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悬赏1流星未解决
本帖最后由 Nianlinliushi 于 2024-3-17 00:51 编辑
1.我遇到的问题：在使用BD FACS Calibur这个型号的流式细胞仪上机检测细胞（K562）凋亡时，在FL1/FL2点图中，细胞总是呈现出对角线形状(像是火箭峰），而不是细胞团，看起来没有明显的阴阳分群。并且我对在上机时，电压与补偿之间调整的规则存在疑惑，尤其是检测单阳管时，电压和补偿调整的先后顺序。
2.我的实验过程：
细胞处理：将六孔板中的细胞收集到ep管中，分别用PBS清洗一次后，尽量吸弃PBS，（使用索莱宝的Annexin V-FITC/PI 试剂盒）每支样品加入100ul的1*bindingbuffer,随后将其转移至流式管中（设置1支空白，1支fitc单染，1支pi单染，1支双染管，其余3支不同药物浓度处理的实验组双染，以及1支阳性药对照组双染),先在相应组别各加入5ul FITC染液，避光，摇床室温孵育15min,结束，在相应组别加入pi染液，避光,摇床孵育5min,结束后每支加入400ul的1*bindingbuffer,避光送至一楼仪器检测，上样前每支涡旋3秒左右。
上机过程：（1)打开电脑中已经设置好的凋亡模板，连接好文件夹，调出各参数面板，勾选four color，P3,P4放大模式为Log,倍增选择E-1。
(2)先上空白组细胞(不加任何药物处理的健康细胞），调节FS-SS点图电压，使得主细胞群在图框中央，再调节FL1-FL2点图电压，使主细胞群处于十字门左下象限。
（3)Standby,继续上单阳管（pi），这里实验室教的方法是先加FL1-%FL2补偿，15左右，让左上象限的少许信号往左边框消失(我们的pi单染一般是不做特殊诱导处理的，健康细胞直接加的pi)，此时的阴性细胞群一般还在左下象限，我们会在补偿后，微调P3,P4电压，让细胞更居于象限中央。*这里我非常疑惑，我认为左上的PI阳性信号不用调走，因为本来就上的pi的单阳管啊，我认为单染时只要信号不在右上的双阳区域，就不用动补偿，但是这和实验室教的方法不一致。*我后来自己试了一次，两单染，补偿仅去除双阳象限信号的方法，细胞也分不开，附第二个FCS文件。
（4）Standby，上单阳管（fitc),奇怪的来了，这个时候右上双阳信号非常明显，而且细胞不成群，呈线形，我们首先加大FL2-%FL1补偿，使得这条线，向下消失在框内，再调P3P4电压，将主细胞群调回左下角。
调补偿
又开始动电压，把细胞调回左下
最后的FITC
最后也只能得到一条线。
（5)最后就是上双染管了，也是得到一条线。
请问为什么，我的每个组别，细胞都分不开，而且是一条线呢？
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发表于 2024-3-17 00:51:06
发表于 2024-3-17 19:52:33