Treg染色的问题

dane113

第一次做流式，向老师们请教一个问题，做Treg 的话，表染的单染管需要加固定破膜剂吗？还是只在foxp3和样本管加就可以？

wxd

是的。而且做胞内染色需要注意：
1. 细胞数量最好能比普通的表染实验多一倍，一般不少于一百万个细胞/样品；
2. 加固定破膜剂前最好能提前利用剩余的少量上清将细胞吹散；
3. 固定破膜后细胞透明，很难看到，所以离心时注意将离心管管盖开口方向统一朝外，弃上清时将枪头伸向离心管底部另一个方向，最好将移液器量程调小一点，留一部分上清在离心管底部。
4. 避免频繁剧烈吹打，一般来说，400g离心5min得到的沉淀，利用加样时的液体流速就可以吹散了，无需刻意混匀。

wxd

表染的和空白对照管都需要加固定破膜试剂，因为固定/破膜会改变细胞大小，可能也会改变表染的荧光特性。加上正常情况下Treg的比例也比较少，必须要有合适的对照来画门，所以需要保持一致。

dane113

wxd 发表于 2024-4-22 10:10
表染的和空白对照管都需要加固定破膜试剂，因为固定/破膜会改变细胞大小，可能也会改变表染的荧光特性。加 ...

在请问下，顺序是先做表染，然后破膜固定，最后染胞内，对吗？

dane113

wxd 发表于 2024-4-22 09:19
是的。而且做胞内染色需要注意：
1. 细胞数量最好能比普通的表染实验多一倍，一般不少于一百万个细胞/样品 ...

谢谢老师，

shupian

我们Foxp3经常是染不上，也不知道啥原因，固定破膜45min,染色45min

niwanmao

shupian 发表于 2024-4-26 09:36
我们Foxp3经常是染不上，也不知道啥原因，固定破膜45min,染色45min

核内标记破膜剂很重要，eB的破膜剂还是首选

shupian

niwanmao 发表于 2024-4-26 09:50
核内标记破膜剂很重要，eB的破膜剂还是首选

老师，我们用的就是eBD的00-5523-00，同样的时间，同样的混匀，我师兄染出来，我就染不出来，好几次了， 我都不知道该咋改进了

niwanmao

shupian 发表于 2024-4-26 11:29
老师，我们用的就是eBD的00-5523-00，同样的时间，同样的混匀，我师兄染出来，我就染不出来，好几次了，  ...

有时候是操作细节
有时候是样本本身问题
有时候是抗体问题

逐一对照、逐一排查，必要时让你师兄帮忙做一个看看

lpp20230609

shupian 发表于 2024-4-26 09:36
我们Foxp3经常是染不上，也不知道啥原因，固定破膜45min,染色45min

破膜时间增加，还染不上那就是供体差异，你选的pbmc批次表达就是低，换个表达高的批次