教你如何更准确地分析单核细胞三个亚群

niwanmao

背景
通过流式细胞术对循环单核细胞进行亚群分析，这一方法被称为“单核细胞表型分析”，在慢性粒-单核细胞白血病（CMML）的辅助诊断中占据重要地位。特别是，当发现经典单核细胞（cMo，表现为CD14++CD16-表型）的比例显著增加，占循环单核细胞总量的比例超过大约90%时，这将高度提示存在CMML的可能性，而非严格限定为94%的标准阈值，因为实际比例可能因不同研究而有所差异。

正常情况下，根据外周血单核细胞表面标志物CD14和CD16的表达水平，单核细胞被划分为三个主要亚群：经典单核细胞（cMo，特征为CD14++CD16-），中间型单核细胞（iMo，表现为CD14++CD16+），以及非经典或异型单核细胞（ncMo，通常定义为CD14-low/NEGCD16+）。在健康人中，cMo约占单核细胞总数的大约85%，而iMo占比约为5%，ncMo则大约占剩余的10%左右。

在CMML患者体内，单核细胞的成熟分化过程发生障碍，表现为cMo群体的累积增多和ncMo群体的数量相应减少。这种特定的单核细胞亚群分布失衡现象构成了利用单核细胞表型分析作为诊断线索的关键依据。


方法
文章中提供了在四种常见流式细胞仪Navios、DxFlex（Beckman Coulter）和BD FACSCanto II、BD FACSLyric（BD Biosciences）上实施单核细胞测定的分步技术建议。步骤一致。

样品制备
- 使用EDTA抗凝的200μL全血
- 稀释WBC计数高的样本，调整至10x10E9/L
- 采用裂解不洗涤染色方案，以避免洗涤对cMo定量的影响

抗体方案
不同流式细胞仪，搭配不同的8色抗体方案，包括荧光染料细节和抗体克隆名称/体积，方案和步骤如下：


关键标记为：
-CD45、CD14、CD16鉴定单核细胞亚群
-CD7、CD56、CD24，分别排除T细胞、NK细胞、B细胞/粒细胞
-可选：slan（M-DC8克隆）以更好地分出ncMo

设门策略
1. 排除碎片、粘连体
2. 粗选CD45高/SSint单核细胞
3. 排除T（CD7+）、NK（CD56+）、B/粒细胞（CD24+）
4. 创建“MONO2”门，排除残留的非单核细胞
5. 从“MONO2”中分析CD14与CD16图上的cMo、iMo、ncMo

分析注意事项
- 使用等高线图可以更准确地对cMo设门
- 目标是获取≥10000个cMo事件
- 计算3个亚群的总和（预期>99.5%）

质量控制
- 理想情况下，24小时内处理样品；室温下最长48小时
- 避免可能影响CD16染色的清洗步骤，见下图


结果
作者对 136 名 CMML 患者进行的初步研究显示
- 使用≥94% cMo 临界值检测 CMML 的特异性为 94.1%，灵敏度为 91.9

随后的多中心研究证实
- 各中心的特异性高达 87-95％
- 灵敏度在 75-100% 之间

容易出现的陷阱
假阳性
- 骨髓恢复期
- 大剂量或小剂量类固醇治疗
- COVID-19 感染

假阴性
- 具有炎症特征的 CMML（“球形分布”，iMo 增高）

• 添加 slan 标记可识别这些病例（ncMo slan+ <1.7%）
• 灵敏度达到 100％
  

该检测方法还能区分
- CMML与反应性单核细胞增多症（特异性为 87.5-100％）
- CMML与某些伴有单核细胞增多的骨髓增生性肿瘤

骨髓分析的灵敏度较低（≥94%的临界值时，灵敏度为87％），原因是难以识别单核细胞祖细胞。


参考文献：Tarfi S, Kern W, Goulas E, Selimoglu-Buet D, Wagner-Ballon O; CytHem‐LMMC. Technical, gating and interpretation recommendations for the partitioning of circulating monocyte subsets assessed by flow cytometry. Cytometry B Clin Cytom. Published online April 24, 2024. doi:10.1002/cyto.b.22176IF: 3.4 Q2