关于流式绝对计数小白有很多问号

Danni

最近想使用赛默飞的计数微珠，但是有很多问题不太明白想请教大家：

1.这种方法是不是可以只上部分样品就能推算整个样品的细胞量了？比如我有1ml全血，现在我只用上50μL就能推算？对占比很低的细胞有没有影响？
2.500uL的上样体系是不是要全部收尽？

niwanmao

用绝对计数微球的时候，有几个关键点：
1、使用前务必充分混匀。
2、全血和微球，可以采取等体积方法，例如全血加50ul，微球加50ul，等体积的话，后面计算上比较方便，只需要将流式图上细胞数量和微球数量做个比值，就等于 真实的细胞绝对数和微球绝对数的比值。
3、上样体积不需要获取完，因为无论获取多少体积，这个比值都是恒定的。
4、免洗，很关键

wxd

如果待检测细胞占比很低的话，有几个建议：
1. 增大上样体积，对同一个样品收集三次，计算平均值和标准差，标准差/平均值得到变异系数（CV），CRO行业里一般认为细胞比例低于1%的话，CV<35%的检测结果是可以接受的；
2. 增加待检测细胞的数量，判断标准同上；
3. 可以通过向高浓度细胞样品中掺入无关细胞制备低浓度细胞样品，或者向零浓度细胞样品中掺入待检测细胞制备对照品。掺入前检测各混合细胞比例，以便得到理论值，从而与检测值做对比，从而验证检测方法的准确性。

hjx

niwanmao 发表于 2024-5-7 08:12
用绝对计数微球的时候，有几个关键点：
1、使用前务必充分混匀。
2、全血和微球，可以采取等体积方法，例如 ...

倪老师，请教一下，这个免洗是指微球吗？我的绝对计数微球如果要免洗的话，只能最后上机前加，那前面样本离心过滤损耗的不一样怎么办呀？最后计数都是不准确的。如果最一开始就加进去，是细胞和微球都要免洗吗？

niwanmao

hjx 发表于 2024-8-30 11:56
倪老师，请教一下，这个免洗是指微球吗？我的绝对计数微球如果要免洗的话，只能最后上机前加，那前面样本 ...

都要免洗

Yuck

建议买BD的绝对计数管子按照说明书操作即可，微球已经提前包到管子里。

hjx

Yuck 发表于 2024-8-31 15:11
建议买BD的绝对计数管子按照说明书操作即可，微球已经提前包到管子里。

我看他们的管子是做血液样本的，我做脾脏、淋巴结可以用的吗？

niwanmao

hjx 发表于 2024-8-31 19:34
我看他们的管子是做血液样本的，我做脾脏、淋巴结可以用的吗？

可以用的，但是实体组织做绝对计数有点难度的，需要先称量重量，再全部研磨成单细胞悬液，计算悬液中的总细胞量，再除以重量，得到每g组织多少细胞

中间会有损失，损失的细胞量因人而异，这是最主要的变异来源

hjx

niwanmao 发表于 2024-9-1 07:35
可以用的，但是实体组织做绝对计数有点难度的，需要先称量重量，再全部研磨成单细胞悬液，计算悬液中的总 ...

好的！谢谢倪老师！因为我想计数脾脏里面的全部T细胞数量，但是微球要免洗的话，我现在想着尝试2种方案：
①研磨成单细胞悬液后，取一部分加计数微球并裂红，上机计算去粘连后的全部细胞数量a。再取一部分裂红染色全套做下来，计算出T细胞数量占总细胞数量的比例b%。最后得到T细胞数量 a*b%，可以避免多次离心的细胞数量损耗
②研磨成单细胞悬液后，加计数微球，染死活，封闭，染色，最后裂红，然后直接上机，全程不洗涤。
想请教倪老师，这两种方法哪种好一点呀？

niwanmao

hjx 发表于 2024-9-1 14:58
好的！谢谢倪老师！因为我想计数脾脏里面的全部T细胞数量，但是微球要免洗的话，我现在想着尝试2种方案： ...

组织样本不洗涤，染色结果会比较难看，所以可能需倾向于1