流式直接法和间接法可以同时做吗

ccchen945

大家好，因为我想看小鼠体内不同Th细胞中某个指标A的表达量，没有考虑体外诱导刺激Th细胞，想直接取材后染Th细胞的marker，目前Th细胞可以通过直接法染细胞因子做出来，但是指标A没有带荧光基团的抗体，需要间接法孵育二抗，所以是否可以在孵完Th细胞的抗体后，再孵指标A的一抗+荧光基团的二抗呢？不知道能否这样做，想请教一下各位老师，谢谢

yun1234

一般来讲是先孵完一抗以后；二抗和直标抗体一起加

niwanmao

首先看你的二抗会不会与其它直标抗体结合？

如果会结合直标抗体，那么建议先染一抗和二抗，洗涤2次后，再染直标。

如果不会结合，那么一抗孵育后，洗涤2次，再接着二抗和直标抗体可以一起加。

通常来说，前者可能更稳妥一点

ccchen945

niwanmao 发表于 2024-6-19 09:18
首先看你的二抗会不会与其它直标抗体结合？

如果会结合直标抗体，那么建议先染一抗和二抗，洗涤2次后，再 ...

非常感谢老师！还想请教一下，请问如何看是否会与直标抗体结合呢？我用的二抗就是平常做切片染色的荧光二抗

niwanmao

ccchen945 发表于 2024-6-19 15:19
非常感谢老师！还想请教一下，请问如何看是否会与直标抗体结合呢？我用的二抗就是平常做切片染色的荧光二 ...

首先看抗体的靶向物种是否相同，其次看抗体亚类。

如果实在无法确定，可直接按照我说的两种方法做平行比对

麦小光

是的，得看你的一二抗来源，如果直标抗体和间标抗体没有任何物种交叉，随便做，但是实际情况是，间标抗体的一抗，大部分是R，M兔子和鼠来源的，而直标抗体的来源相对更丰富一些，但是依然有大量的抗体是R和M。如果物种属性一样，也不代表就一定有反应，比如兔血清中最丰富的免疫球蛋白是IgG，血清浓度为5-20mg/ml。与其他动物的IgG不同。兔只有一种IgG亚型，而小鼠有IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3亚型，大鼠有IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG2c亚型。如果是鼠，亚型不一样，大概率也是不会有太大影响的。但是为了稳妥起见，还是建议采纳倪老师的建议，要么先染一抗和二抗，洗涤2次后，再染直标，要么做平行对照，实践出真知。另外，洗涤液建议添加牛血清白蛋白或者羊血清，洗涤的同时起到封闭的作用，减少二次染色的背景。