检测小鼠脾脏TH17细胞，RORγt标出全阳性

LFC

取出脾脏后，标外标CD45、CD3、CD4、CD8。固定破膜后，标记RORγt，显示全阳性。
并且，我看了CD3里的RORγt也是全阳性，请问哪里有问题呢？


FMO

FMO

实验组

LFC

另外，我想问一下，如果我想一起标RORγt和IL17a，我应该用PMA+莫能霉素+离子霉素刺激吗？

niwanmao

看来还是非特异性结合的缘故
这个抗体是IgG1型、IgG2a、IgG2b型的还是IgM型？

LFC

niwanmao 发表于 2024-7-17 16:11
看来还是非特异性结合的缘故
这个抗体是IgG1型、IgG2a、IgG2b型的还是IgM型？

是IgG2a型抗体

LFC

niwanmao 发表于 2024-7-17 16:11
看来还是非特异性结合的缘故
这个抗体是IgG1型、IgG2a、IgG2b型的还是IgM型？

我搜了一些RORγt说明书，根据Isotype，RORγt也是整体右移的全阳性。
C:\Users\Lenovo\Desktop、4
这是我做的FMO和实验组CD4+的RORγt



这样的话就没办法根据FMO来圈门，那我该怎么圈门呢？

niwanmao

LFC 发表于 2024-7-17 20:11
我搜了一些RORγt说明书，根据Isotype，RORγt也是整体右移的全阳性。

这是我做的FMO和实验组CD4+的ROR ...

首先，优选IgG2b类型的抗体，因为背景最低（同型对照荧光比抗体强，咋办？阻断
https://www.flowcyto.cn/bbs/thread-5510-1-1.html）
其次，接下来解决方案只有先试试Fc Block，可用：
（1）商品化的Fc Block（25ug/ml或10ug/ml）；
（2）2.5％或10%的人血清或小鼠血清；
（3）100ug/ml的人IgG。

最后，最佳的设门对照，就是同样的细胞敲除掉RORγt，但过于复杂，因此推荐先尝试前面的Fc阻断方法

LFC

niwanmao 发表于 2024-7-18 07:52
首先，优选IgG2b类型的抗体，因为背景最低（同型对照荧光比抗体强，咋办？阻断
https://www.flowcyto.c ...

我是加了Fc-block的。
我再查查相关文献吧

niwanmao

LFC 发表于 2024-7-19 09:11
我是加了Fc-block的。
我再查查相关文献吧

有时候问题出在细节上，可参考这篇非常详细的方法学文章：
Analysis of T cells in mouse lymphoid tissue and blood with flow cytometry