小鼠组织刺激后染胞内CD4没有分群

ccchen945

本人想检测小鼠肺组织中Th1、Th2、Th17比例，在刺激后染CD45、CD3和CD4进行圈门时，发现CD4没有阳性群，根据站内提供的方法进行改进，在细胞固定破膜后再染CD4，可是也没有分群，也没有阳性群的表现。目前我使用的CD4抗体是BD（553051，APC Rat Anti-Mouse CD4），想请问各位大佬，是我的抗体问题，或者是其他哪方面有问题呢？谢谢！


补充信息：
之前染过肺组织中未刺激状态下的CD4和CD8，都能比较好的分群，各自比例大概都在40-50%之间
使用的流式仪器是cytoFLEX LX，抗体panel见图，目前CD4通道电压已调到3000了

niwanmao

刺激之前，有没有染过？

CPUSnape

我去，你这个问题也太多了，一时半会儿排查不清楚，我只能告诉你一些排查的思路
1、抗体问题，你的抗体时候可以正常染色，是否过期了，可以用小鼠脾脏和外周血染一下试试，摸清楚这个再做
2、你的流式细胞仪啥型号啊，咋10^4，电压是不是过去了
3、你的肺脏里面有那么多t细胞吗？是不是提取的问题
4、建议把所有的圈门逻辑，仪器型号，质检状态、细胞提取过程，抗体panel，对照管都整理发一下才知道，不然就这样一个图大概率不知道问题原因。

wxd

除了样品、仪器设置的原因外，可能的原因还包括空间位阻。即活化后的T细胞表面，CD4不是单独存在的，它是在TCR复合体中的，如果选的CD4抗体的抗原表位被复合体中的其它蛋白遮挡，确实会导致染色失败。确认这个的方法是：在刺激之前进行染色，全染和单染都做一下。如果全染和单染都正常，说明可能确实是空间位阻的原因，换个不同货号的抗体吧；如果只有单染正常，说明染色失败的原因还包括不同抗体的兼容性；如果全染和单染都失败了，说明抗体有问题，换不同货号或批号的抗体吧。

ccchen945

niwanmao 发表于 2024-7-18 20:45
刺激之前，有没有染过？

老师，刺激之前没有染过

ccchen945

wxd 发表于 2024-7-19 10:27
除了样品、仪器设置的原因外，可能的原因还包括空间位阻。即活化后的T细胞表面，CD4不是单独存在的，它是在 ...

谢谢，我之前做过刺激之前的全染和单染，都是可以做出来的。老师，请教一下，如果需要更换抗体的话，要如何选择抗体呢？

飞翔

wxd 发表于 2024-7-19 10:27
除了样品、仪器设置的原因外，可能的原因还包括空间位阻。即活化后的T细胞表面，CD4不是单独存在的，它是在 ...

啥书呀，看着不错呀

ccchen945

CPUSnape 发表于 2024-7-18 21:40
我去，你这个问题也太多了，一时半会儿排查不清楚，我只能告诉你一些排查的思路
1、抗体问题，你的抗体时候 ...

老师，我补充了部分信息，可以麻烦看一下吗

wxd

飞翔 发表于 2024-7-19 16:31
啥书呀，看着不错呀

基础免疫学（第6版）北京大学医学出版社