求助，细胞固定破膜后，表面染色cd4无细胞群

安英

求助前辈，实验检测nk，t细胞IFNy，按照常规步骤染色，（染色方案，步骤，固定破膜剂如下）。上机时发现fitc cd4没有细胞群，有时apc cd56也没有细胞群，重新加入cd4抗体后，细胞群出现。重复了4次实验，换了全新抗体，还是这样。请前辈们指导一下，有哪些原因导致。

niwanmao

你分别按如下步骤试试 ：
1、直接表面染色
2、加固定剂之后，洗涤后再染


如果1有，2没有，那么应该是固定剂影响该抗体结合；
如果1有，2也有，那么是破膜剂影响。

安英

谢谢倪老师回复。今天我们重新做了一遍实验，把1和2都做了一遍，发现都有群。奇怪的是这次我们按照常规的步骤染色，就是正常固定+破膜后染色也出现了群，感觉做实验怎么玄学啊。之前那么多次实验都没有群。
我们猜测是不是之前实验的细胞数量和抗体的比例不对，于是把样本稀释了1倍，再染色，发现细胞群又不见了难道是抗体浓度不对吗？
下周就要病人的样本了，好着急，实验做不出来结果浪费了样本啊。

wxd

我们之前也出现过PMA和离子霉素刺激后直接染CD4染不上的现象。后来改成固定破膜后染色就好了。鉴于楼主固定破膜之后CD4可以染上，就先直接按照这个能染上的染色方案进行检测。至于原理，后边有空的时候再仔细研究。

我是超人我怕啥

安英 发表于 2024-9-8 21:44
谢谢倪老师回复。今天我们重新做了一遍实验，把1和2都做了一遍，发现都有群。奇怪的是这次我们按照常规的步 ...

可以分享一下原始数据，看看是不是条件没有设置好

danieladaniela

主要原因可能是：PMA刺激导致的CD4抗原发生内吞
具体原理：正常T细胞，CD4与Src家族蛋白酪氨酸激酶p56lck关联可以防止CD4发生内吞。当接受PMA刺激后，CD4与p56lck分离，发生内吞。
解决方式：1、更换CD4抗体：胞内检测细胞因子会见CD4发生内吞，但也不是全部内吞，表染也可以染上，这个时候需要用比较亮的荧光素给CD4，比如：BV421，BV650；如果荧光素亮度比较弱，可能群就不是那么明显。2、按照胞内方式染CD4(固定、破膜后跟着细胞因子一起染），也是可以的。

danieladaniela

CD56，先做单染。另，多收一点细胞数；CD56表达和样本有关。
如果说单染可以，起码证明你的体系（抗体、染色方案）没有问题，样本没有就没有了，少就少了，都属于正常。

安英

感谢各位前辈指导，问题解决了，固定剂和破膜剂没有问题，我使用了现配的brefeldin，cd4群就出现了，昨天跑的aml样本也有群，应该就是brefeldin的原因。之前使用的brefeldin是2个月前配的，冻在了-80冰箱，然后拿出来使用。圈门如图，cd4阳性群和阴性群分的不是很开，但是在十字门可以看的到分界线。