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发表于 2024-10-9 09:21:43
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首先，这个图上看起来没有明显的阳性群，无蛋白A和有蛋白A之间的分群形态基本相似，所以我觉得是没有His+的细胞。
其次，回答一下前面的3个小问题，但本人经验有限，仅供参考：
（1）关于APC anti-His抗体的假阳性问题：
不加蛋白A组与blank组His+门的差异，可能是由APC anti-His抗体的非特异性结合导致的假阳性。这是流式细胞术中常见的问题，尤其是在使用His标签检测时。
减少假阳性的建议：
a) 优化抗体浓度：您已经尝试了1:20和1:100的稀释度，可以考虑进一步稀释至1:200或1:500，找到最佳的信噪比。
b) 调整封闭条件：增加克隆号93的16/32封闭剂的浓度或孵育时间。
c) 使用对照：加入相同浓度的非相关His标签蛋白作为对照，以区分特异性和非特异性结合。
d) 考虑使用其他标签系统：如FLAG标签或生物素标记，可能会有更低的背景。
（2）关于离心步骤的担忧：
可能有些过虑了。蛋白A与其受体的结合通常是相对稳定的，温和的离心不太可能破坏这种相互作用。然而，如果仍然担心影响，您可以：
a) 进行平行实验：一组进行离心，一组不离心，比较结果。
b) 使用温和的离心条件：降低离心速度和时间。
c) 在离心后的上清中检测His标签信号，确认蛋白A是否被甩掉。
（3）寻找蛋白A受体的替代方法：
你说方法是可行的，还有一些其他策略也可以考虑：
a) CRISPR筛选：使用CRISPR库筛选可能的受体基因。
b) 配体-受体捕获技术（LRC-TriCEPS）：这是一种新兴的技术，可以直接在活细胞表面识别配体-受体相互作用。
c) 光交联实验：使用光活化的交联剂标记蛋白A，可以在结合后立即固定相互作用。
d) 蛋白质芯片：使用蛋白质芯片技术筛选可能的相互作用。
e) 双杂交系统：如果可能在酵母或哺乳动物细胞中表达，可以考虑使用双杂交系统。 |
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发表于 2024-10-8 22:01:26
