胞内间标如何进行样本的封闭？

星晴sky

问题：
细胞核标志物REX1采用间标抗体标记，已知REX1在qPCR上阴性表达但是流式检测阳性表达80%，实验结果显示只标记AF488二抗荧光信号与空白对照相比明显右移（图3），同样同型抗体+二抗荧光信号与空白对照相比明显右移（图4），如果按照同型抗体+二抗作阴性对照画门（图4-b），发现REX1一抗+二抗表达80%（图5-b）。
（1）请教各位老师为什么只加二抗和同型抗体+二抗的荧光信号为什么明显右移？
（2）流式间标中空白对照、只标记二抗、只标记一抗、同型+二抗应该用哪个作为阴性对照比较合适？
（3）我看到论坛里有人提到加封闭血清会降低荧光信号，但是厂家的说明书里没有提到加阻断剂和封闭血清，请问各位老师间标过程中需要加入封闭血清吗？
（4）常规的FC阻断剂可以用在间标的过程中吗？
（5）有没有可以推荐的FC阻断剂和封闭血清？

实验试剂

一抗：小鼠抗人REX1（品牌Invitrogen）
同型：小鼠IgG1（品牌Invitrogen）
二抗：山羊抗小鼠AF488（品牌abcam）
固定破膜试剂：Fixation Buffer  品牌BD  货号554655，Perm Buffer III 品牌BD  货号558050

实验步骤
（1）细胞固定 4℃/30min
（2）1mL 1%BSA的 PBS 细胞洗涤一次
（3）细胞破膜4℃/30min，离心
（4）1mL 1%BSA的 PBS 细胞洗涤一次
（5）一抗4℃/30min 孵育
（6）1mL 1%BSA的 PBS细胞洗涤一次
（7）二抗4℃/30min孵育
（8）1mL 1%BSA的 PBS 细胞洗涤一次
（9）细胞重悬，准备上机检测

实验结果：

niwanmao

(1) 只加二抗和同型抗体+二抗的荧光信号明显右移的可能原因:
- 非特异性结合: 二抗可能直接与细胞表面某些分子结合。
- Fc受体结合: 如果细胞表达Fc受体,可能与抗体的Fc段结合。

(2) 阴性对照的选择:
理想情况下,应该使用同型抗体+二抗作为阴性对照。可以控制非特异性结合和Fc受体结合。如果同型抗体不可用,只标记二抗可作为次选。空白对照和只标记一抗通常不是最佳选择。

(3) 关于封闭血清的使用:
虽然厂家说明书未提及,但在间接标记中使用封闭血清通常是有帮助的，可以一定程度上减少非特异性结合,提高信噪比。建议尝试加入10%正常山羊血清(与二抗来源相同)进行封闭。

(4) FC阻断剂在间接标记中的使用:
是的,常规FC阻断剂可以用于间接标记，虽然靶标在胞内，但可以帮助减少表面Fc受体介导的非特异性结合。

(5) 推荐的FC阻断剂和封闭血清:
- FC阻断剂: BD、Biolegend均有商品化阻断剂
- 封闭血清: 正常山羊血清(与二抗来源相同)

建议的改进步骤:
1. 在一抗孵育前,加入FC阻断剂孵育10-15分钟。
2. 在FC阻断后,加入10%正常山羊血清封闭15-30分钟。
3. 继续您原有的染色步骤。
4. 如果背景仍然很高,可以尝试降低二抗浓度或缩短孵育时间。

最后,如果还是不行，可能需要考虑使用不同的抗体克隆或其它检测方法来确认结果。

希望这些建议对您有所帮助。如果您还有任何疑问,欢迎继续讨论。