光谱流式学习问题-灵敏度

Veblen

请问一下老师，最近听光谱流式讲座，技术人员讲到光谱流式中的通道个数（滤光片数量）与灵敏度之间的关系；
说：通道数量不能过多，这样每个滤光片的带宽就很窄，过多的通道会降低检测的灵敏度，所以通道数量不能过多也不能过少；
我想请问为什么通道过多会降低检测的灵敏度呢？不都是全光谱检测吗，通道过多也会全部收集荧光素的发射光，然后参与解析，不就可以了吗？
想听听老师专业的意见，感谢。

hurunhuan

使用滤光片分光的方案，通道越多，排在后面的通道的光需要通过的滤光片的数量就会变多.一般滤光片的通过率是90%左右，也就是光通过一个滤光片信号降到90%，2个就是81%，依此类推。镀膜滤光片透过率可以到95%，最好的滤光片可以到99%，镜片数量多了同样也有很多损失，而且价格也是指数上升的，所以作为量产仪器，成本不太合适。
三棱镜和光栅分光也是同样的问题，如果处理不好，每个表面的光损失在10%-15%。就会导致信号质量变差。
另外，接收器件，不管是PMT还是APD都有最佳光谱范围的，双碱PMT在300-650nm，极限185-850，APD在300-1100，超出最佳光谱范围部分接收性能也会变差，信号强度进一步降低。
最后，再加上放大电路的噪声干扰、ADC模数转换的损失、电源波纹干扰等等，会导致灵敏度下降的非常厉害。

wmj123456

各位老师，关于光谱流式，我想请教3个问题，1第一次做也是要准备单染管的吧，用来进行解析，通常这个单染管可以维持多久，下次做相同方案是不是就不需要单染管了2自发荧光扣除的原理是啥，是利用不加抗体的空白管扣除，把空白管的所有群体都扣除？3看到有篇文章在总结传统和光谱流式区别时，提到光谱流式的通道数大于染料数，染料可复用，是啥意思？

Veblen

hurunhuan 发表于 2025-6-4 07:39
使用滤光片分光的方案，通道越多，排在后面的通道的光需要通过的滤光片的数量就会变多.一般滤光片的通过率 ...

谢谢老师，我觉得讲得非常有道理，而且也能理解。点赞
唯一有一个疑问，现在的光谱流式收光，基本上都是全发射，是不是全反射几乎就不会像光透过那样有光损失，全反射能不能理解为几乎没有光能量损失呢？

hurunhuan

wmj123456 发表于 2025-6-5 22:48
各位老师，关于光谱流式，我想请教3个问题，1第一次做也是要准备单染管的吧，用来进行解析，通常这个单染管 ...

1.单染管的使用和维持时间：
是的，第一次做光谱流式分析时，通常需要准备单染管。这些单染管的作用是为了解析每个荧光染料在设备中所占的光谱范围。单染管可以帮助你区分不同染料的光谱信号。一般机器状态没有变化，染料批号没有换，细胞类型一样，就不需要再做了。

自发荧光扣除的原理：
自发荧光扣除的目的是为了减少细胞本身的自发荧光，它可能会干扰你所关注的信号。通常，空白管是用来进行扣除的。是否整体扣除，要看仪器软件，一般是需要圈出主群细胞，在主群细胞中扣除它们的自发荧光，如果细胞种类多，并且可以圈出不同的细胞群，可以添加多个自发荧光扣除的数据，就是把每一种细胞的自发荧光，当作另一种染料染色来看。在对应细胞中扣除对应的光谱。

光谱流式通道数与染料数的关系：
传统流式细胞仪的每个通道只能识别一个特定的荧光信号（与特定的染料对应），所以染料数量通常等于通道数。而光谱流式细胞仪则是基于整个光谱范围进行检测，可以同时解析多种染料的信号。由于光谱流式的检测方法是基于光谱特征的，它能够区分相似的荧光染料，即使它们在传统流式细胞仪中可能被归为同一通道。这使得染料可以复用，即同一个染料可以被分配到不同的通道，这样就能有效提高实验的灵活性和通道的使用效率，从而支持更高通道数的多重染色。

hurunhuan

Veblen 发表于 2025-6-5 23:20
谢谢老师，我觉得讲得非常有道理，而且也能理解。点赞
唯一有一个疑问，现在的光谱流式收光，基本上都是全 ...

上面也提到的，如果处理不好，每个表面（反射面）都会有10%到15%的光损失。所谓的全反射，也不能做到真正100%的反射，只是达到同样的反射率的成本比透镜达到同样透过率的成本低很多。
大部分设计都是成本考虑，没有哪个技术就一定高端的。
流式能用到的技术原理，基本上都是应用超过50年-100年的非常成熟的技术，就算是BD最新的S8，用到的BD CellView™成像技术，听起来看起来都非常高大上，实际上电镜早就用了多少年了。拉曼光谱流式也是，拉曼光谱的发现和测量距离现在都接近100年了。