多色流式为啥经常看到细胞信号在坐标轴上“摊大饼”？

niwanmao

你是否遇到过这样的场景：明明按说明书把补偿矩阵算得一丝不差，可散点图上阴性群还是“摊大饼”，边缘甚至压到坐标轴；设门时左挪右移，总怀疑自己是不是补偿没调对。



Mario Roederer 在 2001 年用一篇经典文献告诉我们——这未必是你的错，而是光子和电子本身在捣乱。

一、多色时代的“补偿焦虑”  
20 世纪 90 年代末，8 色、10 色甚至 11 色流式组合开始出现，光谱spillover不再是简单的两两配对，而是一张更大的 N×N 的矩阵。

Roederer 团队在 NIH 疫苗研究中心搭建 11 色 13 参数体系时，发现一个令人困惑的现象：  
- 即使软件显示补偿系数已完全计算正确，阴性群仍然呈扇形扩散，边缘压到坐标轴；  
- APC 通道尤其严重——虽然 APC 本身亮度极高（信噪比>100），但补偿后分布宽度反而比自体荧光宽 3–5 倍；  
- 用传统“十字门”或“象限门”统计时，假阳性率可达 2–8 %，远高于单染对照的预期。  



这些异常无法用 log 放大器误差单独解释。于是作者构建了一个数学模型，把光子计数误差、测量误差、离散化误差一起纳入，系统回答：  
1) 补偿后数据为什么会“摊大饼”？  
2) 到底能不能靠肉眼在散点图上把补偿“调回去”？  

二、研究方法
1、实验部分  
- 标本：Ficoll-Hypaque 分离的人外周血单个核细胞（PBMC）。  
- 染色：  
  – 实验1：FITC-CD3、PE-CD4、Cy5PE-CD8（三管单染做补偿对照）。  
  – 实验2：APC-anti-CD57（自偶联），另加 ND1、ND2 中性密度滤片分别降低 10×、100× 光强，模拟不同光子通量。  
- 仪器：改装的 FACSVantage SE，激光 488 nm + 647 nm，APD 与 PMT 混合检测。  
- 数据：1024 通道、4-decade log 存储，FlowJo 3.3.3 补偿，JMP 4 建模。  

2、数学模型  

模型用 Excel/JMP 实现，核心变量如下：  
- CF：主检测器通道值（0–1023）。  
- DS：副检测器信号 = 自体荧光(AF) + 光谱泄漏(s·DF) + 光子计数误差(√P) + 系统误差(E)。  
- 误差类型：  
  – 光子计数误差：与信号平方根成正比（√P）。  
  – 测量/离散化误差：与信号成正比（E）。  
- 输出：补偿后通道值 Cs，观察其与 CF 的散点图形态。  

三、结论与对我们的实际操作指南——如何与误差和平共处
文章中的结果偏理论化，可能大家比较难以理解，我们就直接来说一下对我们实际上的操作指导吧。

1、误差无法归零  
- 光子计数误差是物理极限，无法消除；  
- 离散化误差可降到 0.0035 %（16-bit 线性存储），但无法完全消除。  

2、平时实验设计时  
- 尽量选更亮、spillover 更小的染料；  
- 减慢流速、提高 NA（Numerical Aperture，数值孔径，NA 从 0.5 提升到 0.9，理论上可把光收集效率提高约 2–3 倍，直接降低光子计数误差）、用更宽滤片（把 30 nm 带宽的滤片换成 50 nm 或 60 nm，意味着允许更多波长的光进入探测器；在信号本来就弱的远红光区（如APC-Cy7），可把有效光子数提高 30–60 %。代价是相邻染料的spillover可能增加，需要重新评估补偿矩阵。因此要在“收集更多光子”和“控制串色”之间做权衡，而不是无限加宽）提高光子收集效率；  
- 至少 18-bit 线性存储，再做软件补偿。  

3、设门策略  
- 放弃传统十字门；  
- 使用 FMO（fluorescence-minus-one）对照，画出非线性的阴性边界；  
- 用软件自动计算 median 或 median-deviation gate，避免肉眼调补偿。  

4、软件设置  
- 在 FlowJo、WinList 等软件中开启“median line”或“FMO gate”功能；  
- 补偿后先检查 FMO 阴性群，再画阳性门。  

最后我们回答标题提出的问题， [mono]多色流式为啥经常看到细胞信号在坐标轴上“摊大饼”？[/mono]，形象一点解释：

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补偿不是“一调就好”的魔法，而是一场与光子和电子的谈判。理解误差来源，才能在 15 色、20 色甚至更高维度的实验中，既看见真实的生物学信号，也避免把噪声当成新发现。

1. 参考文献：Roederer M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 2001;45(3):194-205.

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