小鼠特异性抗原记忆B细胞流式分选

勇敢扭扭

各位大佬，我们打算用流式分选小鼠记忆B细胞，有查到有试剂盒可以筛小鼠记忆B细胞，不过我们打算更进一步筛出来抗原特异性结合的记忆B细胞，我们现在确定的是有荧光抗原，但其他的表面标志物不确定需不需要，也不知道具体实施起来有什么困难，请问有没有大佬可以解惑。

niwanmao

刚才在另一个问题里面回答了下（https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=redirect&goto=findpost&ptid=7897&pid=67139），在这里确定了有荧光抗原，那就相对好很多了。

通常，分选设门策略可考虑以下因素：
1、泛B细胞标记，例如B220（CD45R）或CD19。
2、荧光标记抗原，用于识别特异性结合它的B细胞。为了防止非特异性结合产生的假阳性，可考虑使用“多聚化”抗原方法（例如，通过将抗原连接到两种不同的荧光染料上，并且只分选两种染料双阳性的细胞）。
3、排除未成熟B细胞：未成熟B细胞同时表达IgM和IgD。为了排除这些细胞，你可以分选IgD阴性或IgM表达低的细胞。
4、记忆B细胞标记：可考虑CD80、CD73和PD-L2（CD273）。
5、排除浆细胞：虽然记忆B细胞可以快速分化成浆细胞，但浆细胞本身不是记忆B细胞。浆细胞的一个常见标记是CD138（Syndecan-1）。分选时有必要排除掉CD138阳性的细胞。



可能遇到的问题：
1、抗原特异性记忆B细胞是一个稀有的群体，尤其是在免疫接种后很长时间。可能需要收集大量的脾细胞或淋巴结细胞，才能获得足够的数量。
2、脾脏或淋巴结细胞悬液可能含有死细胞和碎片，可能会导致细胞聚集并堵塞流式细胞仪的喷嘴。加入DNase并通过细胞滤网过滤悬液有助于防止这种情况。
3、高速分选会对细胞造成物理应激，会影响它们的活力和下游功能。分选条件需要优化，分选后要轻柔地处理分选后的细胞。
4、某些细胞具有内在的荧光，这可能会干扰你的结果。死细胞和巨噬细胞尤其容易干扰，可考虑使用死活染料（如PI或DAPI）来排除死细胞。
5、荧光抗原探针可能会非特异性地结合到其他细胞类型或Fc受体上。可以使用Fc受体阻断剂最大限度地减少这种情况。前面提到的「多聚化」也有助于减少非特异性结合。

勇敢扭扭

niwanmao 发表于 2025-10-25 12:02
刚才在另一个问题里面回答了下（https://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=redirect&goto=findpost&ptid= ...

这些荧光标记物质的数量有可以减少的可能吗？
比方说泛B细胞（B220（CD45R）或CD19）和记忆B细胞标标记（CD80、CD73和PD-L2（CD273）），我只用CD273一种标记物可以吗？因为我们已经用记忆B细胞试剂盒进行了一次筛选，基本可以确定细胞是记忆B细胞，然后在具体操作的时候CD273验证一下，这样就能减少很多的荧光物质的应用，比较担心太多的荧光物质会影响实验结果；

niwanmao

勇敢扭扭 发表于 2025-10-25 13:26
这些荧光标记物质的数量有可以减少的可能吗？
比方说泛B细胞（B220（CD45R）或CD19）和记忆B细胞标标记（ ...

前面用了什么标记筛选呢？

勇敢扭扭

niwanmao 发表于 2025-10-25 13:42
前面用了什么标记筛选呢？

具体过程是这样，
我们打算先用记忆B细胞分选试剂盒从小鼠脾脏中提取记忆B细胞；
   （这个时候大概就都是记忆B细胞了，当然也有可能有其他的细胞，但记忆B细胞的占比应该是最大的）
下面是我们打算进一步筛选抗原特异性记忆B细胞的一个过程；
       Viability dye vs SSC-A：选择活细胞（Viability dye阴性群体、Live/Dead阴性群体）；
       CD273+：验证记忆B细胞群体；
       IgG+：圈选 IgG+ 的群体；
       抗原双阳性：这是关键的一步。圈选同时结合两种荧光标记抗原的细胞群。

niwanmao

勇敢扭扭 发表于 2025-10-25 13:53
具体过程是这样，
我们打算先用记忆B细胞分选试剂盒从小鼠脾脏中提取记忆B细胞；
   （这个时候大概就都 ...

如果明确是用特异性高的记忆B细胞分选试剂盒分选过了，那么只需再用抗原筛选即可。

Star Protocols上面有一篇你们可以参考一下，先富集B细胞，再用荧光标记抗原的SpyCage试剂替代四聚体富集抗原特异性B，最后再用B220 PerCP/Cy5.5 (1:300)、IgD Spark NIR (1:800)、GL7 eF450 (1:300)、CD38 APC (1:250)、CD3 APC/Fire 810 (1:200)、 F4/80 PE/Cy7 (1:250)方案做流式分选。这样三步。
疟原虫感染小鼠的抗原特异性B细胞_compressed.pdf (2.32 MB, 下载次数: 4)

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勇敢扭扭

niwanmao 发表于 2025-10-25 14:11
如果明确是用特异性高的记忆B细胞分选试剂盒分选过了，那么只需再用抗原筛选即可。

Star Protocols上面 ...

谢谢倪老师，我去研究研究

勇敢扭扭

niwanmao 发表于 2025-10-25 14:11
如果明确是用特异性高的记忆B细胞分选试剂盒分选过了，那么只需再用抗原筛选即可。

Star Protocols上面 ...

倪老师，这篇文章中是先富集了全B细胞，然后用荧光抗原特异性试剂去标记特异性细胞，到这一步是不是就可以结束了；
我们本来是打算把抗原特异性标记的记忆B细胞进行分化培养，取上清在进行一次检测，确定分泌抗体的细胞孔，这么一来的话，我们好像没必要再添加这么多的荧光标志物了。
就像您说的，用特异性高的记忆B细胞分选试剂盒分选过后，只需再用抗原筛选即可；

niwanmao

勇敢扭扭 发表于 2025-10-28 16:14
倪老师，这篇文章中是先富集了全B细胞，然后用荧光抗原特异性试剂去标记特异性细胞，到这一步是不是就可 ...

不是，还有第三步，就是流式分选第二步抗原纯化的特异性B里面的记忆B

勇敢扭扭

niwanmao 发表于 2025-10-28 16:16
不是，还有第三步，就是流式分选第二步抗原纯化的特异性B里面的记忆B

哦哦哦，我大概理解您的意思了，这篇文章中是从第二步筛选的特异性B细胞中通过B220、IgD、CD38......这些标志物筛选出来记忆B细胞，您之前说的用特异性高的记忆B细胞分选试剂盒分选后，只需再用抗原筛选就可以是因为我们已经得到记忆B细胞了，抗原筛选后就得到我们想要的细胞了，如果只是像文章中那样从全B细胞中用抗原筛了特异B细胞，就得再筛一次记忆B细胞。