小鼠肺组织细胞过夜刺激活率问题

shiyisyl

倪老师，各位老师， 好！我取小鼠肺组织处理成单细胞悬液，做体外过夜刺激、做ICS时，细胞活率很低，这是怎么回事？ 取小鼠肺组织的当天，细胞做表染的话，活率在70~90%左右；但是同样的细胞，做ICS时，过夜刺激完，细胞活率很低，好的时候能有20~30%，差的时候8~10%左右。 刺激物：蛋白（不含DMSO），外加终浓度是2ug/mL的CD28和CD49e；刺激物、BFA和细胞同时加到U底板子上，刺激时间大概在18~24h。 BFA是用的biolegend的，1:1000用的。也测试了1:1000、1:2000和不加BFA刺激的测试，不加BFA时，活率有40~50%左右；加了BFA就30%左右。感觉活率依旧提不上去。 单细胞悬液制备时，用的是stemcell的胶原酶/透明质酸酶混合液+DNA酶I，货号分别是：Catalog # 07912和100-0762，DNA酶有时候用国产的，瀚海新酶，感觉和stemcell的没啥差别。1个小鼠肺组织，加800uL消化液，37℃消化17~20min，再用2%FBS稀释后，再70um的细胞筛网上研磨成单细胞悬液。 以下是流式的图片结果。

niwanmao

我个人猜测有以下原因：
1、解离造成的压力和损伤可能会使细胞变得脆弱，无法承受更长时间的过夜孵育，虽然刚解离时活性还好，但仍可能导致延迟发生的细胞死亡
2、BFA能抑制蛋白质从内质网转运至高尔基体，也能够诱导细胞凋亡，尤其是在应激细胞中
3、培养体系是否仍需优化？

建议：

1. 采集小鼠肺组织前，用PBS/EDTA或HBSS灌注，以尽可能清除血液。使用温和、优化的酶消化方案，有时候降低酶浓度或缩短消化时间也能获得成功。使用 DNase 可以最大程度地减少死细胞成团。消化后，使用细胞碎片去除试剂盒或密度梯度离心法（例如 OptiPrep）去除死细胞和碎片，然后再进行刺激。  刚解离制备成功的时候，测一下Annexin V/PI确认一下细胞活力，可能比单纯PI或其它死活染料更准确，更能发现一些早期凋亡现象，从而确定究竟是初期制备就出了问题还是后期培养、刺激时出了问题
另外，酶消化后保持所有试剂和样本均处于低温状态，以尽量减少细胞压力。
2. 对于过夜刺激，可以在最后4-6小时加入BFA，而不是全程18-24小时均用BFA。这样既 可以有效阻断细胞因子的分泌，又能最大程度地缩短毒性应激的持续时间。如果仍不太好，可考虑降低BFA浓度。
3、在过夜培养过程中原代细胞密度高一点可能会更好一些。

shiyisyl

niwanmao 发表于 2025-10-27 14:31
我个人猜测有以下原因：
1、解离造成的压力和损伤可能会使细胞变得脆弱，无法承受更长时间的过夜孵育，虽然 ...

倪老师，我采取您的建议再测试一下样本制备。
另外，想再请教一下，我用的这个胶原酶是：胶原酶和透明质酸酶的混合物，可能是胶原酶I ，胶原酶I 有没有可能造成细胞损伤更严重呢？是否有必要换成胶原酶 IV呢？

niwanmao

shiyisyl 发表于 2025-10-27 15:46
倪老师，我采取您的建议再测试一下样本制备。
另外，想再请教一下，我用的这个胶原酶是：胶原酶和透明质 ...

可以的，另外Liberase也可以试试

shiyisyl

niwanmao 发表于 2025-10-27 16:10
可以的，另外Liberase也可以试试

谢谢倪老师~