血小板表面活化指标CD62P、PAC-1流式检测的困惑

vtea

  跟着医院老师和研究生做本科毕业论文选择了有关“瑞舒伐他汀对冠心病患者CD62P、PAC-1指标的影响”，实验刚开展前由于同型对照的试剂暂时没有，就在没有同型对照开展过得情况下测了几例标本，后来试剂到货后正式得进行检测，却发现同型对照进行前后所得的结果相反，不知道为什么？求老师的解答！

病人编号	治疗前	治疗后	治疗前	治疗后	治疗前	治疗后
	UL(GATE%)	UL(GATE%)	UR(GATE%)	UR(GATE%)	LR(GATE%)	LR(GATE%)
2a1	17.02	6.66¯	29.15	2.9¯	24.29	15.95¯
3a1	4.67	0.45¯	11.94	1.03¯	27.47	0.15¯
6a1	5.97	3.45¯	20.55	8.95¯	40.60	36.13¯
7a1	5.98	6.6	7.38	28.23	32.46	48.03
10a1	6.78	1.69¯	8.20	1.6¯	19.12	8.24¯
12a1	13.59	1.97¯	2.69	0.45¯	7.38	1.26¯
13a1	1.37	7.14	2.66	2.94	15.38	12.36¯
14a1	1.76	1.18¯	3.28	1.87¯	16.77	8.28¯
17a1	0.60	1.68	0.81	2.01	9.22	14.32
18a1	2.26	2.99	2.06	35.33	2.57	44.57
24a1	2.6	5.5	1.98	49.95	10.68	30.57
UR	DOUBLE
UL	CD62P
LR	PAC-1
红色数据：做完同型对照所得数据

  

niwanmao

1、用同型对照之前，你们以什么为标准设置阳性阴性分界线？
2、同型对照与抗体是否匹配？
3、有图吗？放几个点图上来更好判断。

vtea

谢谢倪老师！
实验是去年10月刚开始的，我对流式具体操作的了解几乎是空白，一直跟研究生摸索学习。前期工作如电压、荧光补偿、门的设定等都是由BD公司的工程师操作，以 CD61PerCP/SSC双参数设门~同型前后大致操作好像都差不多，不知道这样子两者数据是否有可比性？
如果没有记错的话，同型对照与抗体是相匹配的（具体还得去医院看一下）。医院用的流式型号是FACSCalibur（BD公司），研究生还在做的是有关内皮祖细胞相关指标的检测（他也是Flower，也给您提过问题），他做的结果就很好~~
实验测的是冠心病患者入院时与服用瑞舒伐他汀24h后的值，没有找到此类文献（部分文献说阿伐他汀/辛伐他汀用药症状明显改善后，CD62P下降），病人还大多做过造影，服药时间短……这些因素不知导致数据升高的原因之一？
      现在没有图，等周一去医院采集完后再向您请教。

vtea

niwanmao 发表于 2012-4-6 10:42

                               
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1、用同型对照之前，你们以什么为标准设置阳性阴性分界线？
2、同型对照与抗体是否匹配？
3、有图吗？放几 ...

倪老师您好!今天去医院问了负责老师和研究生，情况是这样的：
1、同型对照和抗体的确是匹配的，且都是BD公司的
2、做同型对照之前的实验分界线是随便划的，等做完同型对照后又利用新的模板重新修改得到的数据
3、主要的实验步骤是这样的：抽取新鲜静脉血液（枸橼酸盐抗凝）2ml，在硬质试管中加入标本5ul，再加入PAC-1 FITC、CD62P PE、CD61 PerCP各10ul，在漩涡混合器上混匀后于4℃冰箱避光静置15min。再加入4℃预冷1%多聚甲醛溶液1ml，4℃冰箱避光静置30min。以上过程大多在30min完成，以减少血小板体外活化，最多1h完成。标本制备后一般在2h内检测完毕


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2012-4-9 22:30 上传

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不知道数据上升的具体原因怎么解释？同型做完后的几例今天没能下载下来，不知道这几个图够不够……虽然医院老师并不要求本科生什么都明白，但我希望能利用这个机会对流式有一点了解，也许读研能用上。
P.S.由于数据升高无法解释，现在已经不做药物对PAC-1、CD62P影响的实验了，而是改做术前及术后24小时内多点检测PAC-1、CD62P的变化，据初步实验看，这两个值呈现逐步下降趋势，没有出现过药物影响实验时结果升高的情况

niwanmao

vtea 发表于 2012-4-9 22:31

                               
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倪老师您好!今天去医院问了负责老师和研究生，情况是这样的：
1、同型对照和抗体的确是匹配的，且都是BD ...

看了图，我觉得你们设门上有点问题。你们的想法是通过CD61来设门，这是对的，但是由于血小板非常小，而且容易粘附在淋巴细胞、粒细胞、单核细胞等上面，所以你图中的那个有可能圈中很多淋巴细胞。
参见：http://www.flowcyto.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=668 ，这里你就可以看到CD61阳性的细胞还有那群绿色的，可能是淋巴细胞。

我建议你们采用FSC/SSC的log模式获取，圈中间那群，设为R1，然后再选择CD61阳性的细胞，设为R2，最后分析（R1 AND R2）中的CD62P和PAC-1的表达。

也可以采用（http://www.flowcyto.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=668）中的设门方法，直接圈CD61阳性、SSC中等偏小的细胞，直接进行分析。

vtea

niwanmao 发表于 2012-4-10 09:05

                               
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看了图，我觉得你们设门上有点问题。你们的想法是通过CD61来设门，这是对的，但是由于血小板非常小，而且 ...

太谢谢倪老师了！我和他们说一下您的建议，说不定还可以继续进行实验呢！

孤鸿影残

倪老师你好！我们想检测过滤血浆中白细胞对血小板表面活化指标CD62P、PAC-1的影响，由于条件限制不能采血后马上染色，且血浆是用来长时间保存的，主要是想了解做白细胞过滤对这两个指标的影响，不知是否也可以用固定法去做？这样到时做出的结果CD62P、PAC-1的值是不是应该偏高？

染色
a. 全血法：

1) 取试管A(阴性对照)和试管B(测定管)，均加入5ml 抗凝全血和200ml PBS
2) A管中加入适量的CD42b-FITC和阴性对照抗体(对应于CD62-PE或CD63-PE)
   B管中加入适量的CD42b-FITC和CD62-PE或CD63-PE抗体
3) 室温，避光孵育25分钟
4) 加2 ml PBS，上机检测
血小板在体外随着时间的延长会自发活化，所以由采血到检测一般要在3小时内完成。

b. 固定法：

1)  抗凝全血 800rpm 离心10分钟，取上清液即PRP(富血小板血浆)
2)  以等体积1-2%的多聚甲醛固定 10分钟
3)  PBS洗涤1次，用PBS调节细胞浓度为 1×107个/ml左右
4)  分别在试管A(阴性对照)和试管B(测定管)进入100ml血小板悬液
5)  A管中加入适量的CD42b-FITC和阴性对照抗体(对应于CD62-PE或CD63-PE)
     B管中加入适量的CD42b-FITC和CD62-PE或CD63-PE抗体
6)  其余步骤同全血法
固定法可避免血小板在体外因时间或操作造成的人为活化，固定后的血小板可在5天内检测。

另外有说这样进行血小板激活的：
(1)试管内加入50mlADP，450ml全血，轻轻摇匀。
(2)室温孵育5分钟。
(3)立即染色。
血浆也可以直接这样做吗？是不是激活后PAC-1阳性率会很高？

问题有点多，呵呵.....
谢谢！

孤鸿影残

niwanmao 发表于 2012-4-10 09:05
看了图，我觉得你们设门上有点问题。你们的想法是通过CD61来设门，这是对的，但是由于血小板非常小，而且 ...

请多多指教！谢谢！

一成天

详细的学习，真是涨姿势啊