细胞量与PI、RNase浓度

ericazy

我在用PI染色过流式分选，分出的不同时期细胞提取DNA，因为DNA量有要求，所以分出来的细胞量也要足够。因此每次分的话我准备用10^7个细胞。一般protocol都是10^6个/ml的浓度，如果我要用10^7/ml的话，请问是不是需要把RNase和PI浓度都增加十倍到200ug/ml和500ug/ml？还是说应该用10^6/ml，一共10ml去分（我觉得有点多会分得比较久），主要是流式仪器的老师说仪器上10^7浓度的没问题。

niwanmao

你可以把样本体积加大嘛，假设需要获取总数达到10^7，那么固定、洗涤、离心后就用10ML的染色液就行了，这时的细胞密度刚好是10^6/ML。染色液的浓度尽量别去动它，因为是大家摸索出来的最佳条件。

gcz5340

注意到楼主说的是PI染色然后流式分选，但是PI法检测细胞周期一般都是乙醇固定后的死细胞，分选后肯定是不能培养的。如果是分选后抽蛋白之类的，也要考虑可能可溶性蛋白会流出胞外的可能。现在有人来我们这边用Hoechst染细胞周期（Hoechst可以染活细胞DNA）分选，但几次做下来效果都不好，没有典型的周期峰，正在为这是犯愁呢，不知道有没有战友有这方便的经验。

niwanmao

gcz5340 发表于 2012-7-11 21:24

                               
登录/注册后可看大图

注意到楼主说的是PI染色然后流式分选，但是PI法检测细胞周期一般都是乙醇固定后的死细胞，分选后肯定是不能 ...

楼主是提DNA，所以问题不大。

活细胞染色这些染料的条件确实很难摸，只能反复试不同浓度和不同时间梯度了：Hoechst染料的最佳染色浓度和时间在不同的细胞中是不一样的，因为染料的摄取依赖于细胞代谢率。通常，染料浓度在1μg/ml至10 μg/ml 之间，孵育时间在20 min 至 90 min之间，可做出较好的细胞周期结果。