关于GFP荧光自发降解问题

xhxiejing · 发表于 2012-9-13 17:40:33

gcz5340 发表于 2012-9-12 22:33

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你说的荧光强度下降是指mean值吗，百分比有变化吗，重复几次都这样吗，能否上图看一下？一般来说GFP是很稳 ...

我的目的蛋白是和GFP偶联的，他们在细胞内收到药物刺激时，目的蛋白被降解，与之相偶联的GFP蛋白也因此降解，这样荧光强度的下降就能指示我的目的蛋白的量了。我整理一下图，上图哈

xhxiejing · 发表于 2012-9-13 17:43:31

gcz5340 发表于 2012-9-12 22:33

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你说的荧光强度下降是指mean值吗，百分比有变化吗，重复几次都这样吗，能否上图看一下？一般来说GFP是很稳 ...

我是看mean值，这个问题基本在我每次实验中都会发现。百分比，您是说带有荧光的细胞占总细胞数吗，因为我稳转细胞阳性率几乎百分之百，所以就没有看百分比了。

xhxiejing · 发表于 2012-9-13 18:41:20

gcz5340 发表于 2012-9-12 22:33

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你说的荧光强度下降是指mean值吗，百分比有变化吗，重复几次都这样吗，能否上图看一下？一般来说GFP是很稳 ...

这是我选了两个图，一个是我在避光，插冰上的条件下，另一个是不避光，室温条件下。还请老师帮忙分析下，谢谢啦。

xhxiejing · 发表于 2012-9-13 18:48:16

第一个图中，FM1的mean值是247，FM2的mean值下降为210. 第二个图中，none1 的mean值为228,5分钟后测得none2 的mean值为203，几分钟后再测none3，mean值下降为187

mybbff · 发表于 2012-9-13 20:36:50

我以前做细胞免疫荧光的时候用冰冻甲醇固定过GFP，可以试试看。甲醇装到小瓶子，头一天放到-20C。

niwanmao · 发表于 2012-9-13 21:43:35

xhxiejing 发表于 2012-9-13 18:48

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第一个图中，FM1的mean值是247，FM2的mean值下降为210. 第二个图中，none1 的mean值为228,5分钟后测得none2 ...

看来像@mybbff 站友所说，你的标本看来是得固定，你可以多聚甲醛和冰甲醇都试试。
冰甲醇据我读到的资料可能对细胞形态影响比较大，不过由于你是细胞株，只有一种细胞，无所谓

xhxiejing · 发表于 2012-9-13 22:31:03

mybbff 发表于 2012-9-13 20:36

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我以前做细胞免疫荧光的时候用冰冻甲醇固定过GFP，可以试试看。甲醇装到小瓶子，头一天放到-20C。 ...

谢谢您的建议，那再请问，上机时是直接用冰冻甲醇来重选细胞吗，还是加成多少浓度的甲醇呢？

mybbff · 发表于 2012-9-13 22:33:07

我没用这个办法做过FACS，制作过细胞免疫荧光。甲醇是百分百的。

gcz5340 · 发表于 2012-9-13 23:20:09

还是没想到你这个是什么原因，但是从你的图中看，不知道你为什么FSC和SSC会选log呢，圈的群体也很怪，另外你的GFP图中population有没选择G1，看你第一个FSC/SSC图中黑点掺着红点，对于细胞株的话应该如下图：

还是觉得固定没有什么用处，固定只是把蛋白交联在固定的位置，如果有楼主所说的降解情况，还是没办法避免，不可确实可以试一下。

niwanmao · 发表于 2012-9-14 10:56:45

gcz5340 发表于 2012-9-13 23:20

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还是没想到你这个是什么原因，但是从你的图中看，不知道你为什么FSC和SSC会选log呢，圈的群体也很怪，另外 ...

@xhxiejing 用的是FCS Express，是不是显示的问题？而不是没圈中那群细胞？

我还是之前那个看法，应该不是降解，而是漏出去，所以固定可以试试 @xhxiejing

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