请大师和高手看看原因为啥？

穿越地平线 · 发表于 2012-9-23 21:10:47

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这是人的外周血采用全血裂解法测EPC的含量，本人就是弄不明白为什么两次流式结果差别这么大？第一次双标数值为0.1%，第二次双标数值为0.6%。注CD34为FITC标记，KDR为PE标记。

穿越地平线 · 发表于 2012-9-23 21:12:40

穿越地平线 · 发表于 2012-9-23 21:21:05

上面两个是7.20跑的，下面2个是今天跑的，数值差别太大了。不解，同一个人做的。用的同样的方法。步骤如下：

人外周血流式操作流程

1.在EDTA.K2抗凝管中抽取外周血1-2ml

2.加入1X红细胞裂解液10ml,混匀，室温孵育15分钟（参照说明书）

3.1000rpm离心5分钟

4.弃上清，混匀，加入3-5ml　PBS，1000rpm离心5分钟 *2次

5.加入4%PFA3-6ml(根据细胞计数调整加入量）重悬，置于4℃

6.从4°冷库取出样本，吹打混匀，取400ul至于EP管中，1500rpm离心5分钟

7.弃上清，加入300ulPBS重悬后加入流式抗体CD31并置于4°暗室孵育30min

8.1500rpm离心5分钟

9.弃上清，加入500ulPBS重悬后再次1500rpm离心5分钟

10.弃上清，加入400ulPBS重悬后至流式管中上机

穿越地平线 · 发表于 2012-9-23 21:21:37

拜谢！我只是想是不是自己没洗好所致？

niwanmao · 发表于 2012-9-23 22:15:34

穿越地平线发表于 2012-9-23 21:21

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上面两个是7.20跑的，下面2个是今天跑的，数值差别太大了。不解，同一个人做的。用的同样的方法。步骤如下 ...

cd34和kdr在哪一步加入没有讲嘛？还有，抗体孵育一般体积都是100微升，你为什么用300？

穿越地平线 · 发表于 2012-9-24 00:31:08

第7步加的抗体，我们只要达到跑流式的细胞数目不就行了吗?

niwanmao · 发表于 2012-9-24 08:54:06

穿越地平线发表于 2012-9-23 21:12

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将你的PDF都转换成图片了，以方便大家讨论。

看了下图，你指的可能是第1、2两个图的比例吧？第一个图文件名写着自身对照，是指同型对照还是阴性对照？第二个图的CD34荧光强度我看着就象非特异性的增高，十字门应该是往上移的。

关于你的protocol，你还没有理解孵育时体积的重要性，请参见这个帖子（http://www.flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=viewthread&tid=1755），孵育时的体积很重要，最后的上机体积多少无所谓，但孵育时一定要保持在100ul以内。

穿越地平线 · 发表于 2012-9-25 01:21:58

版主你好，是5+的Q2和16+的Q2-1，这是同一个病人标本，标本当时处理完就用PFA固定后稀释成5ML放在4°冰库了，为什么2次结果差这么大？

穿越地平线 · 发表于 2012-9-25 01:22:23

而且两次都是我自己跑的，操作步骤一样的。

穿越地平线 · 发表于 2012-9-25 01:23:39

带减号的为阴性对照。

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