阳性细胞与阴性细胞没有明显分群

renping_jsnj

如图所示，在做B  cell activation study时遇到B220的染色不能分开阳性和阴性细胞群的问题。该问题只出现在rat whole blood，在做mice，human的时候群分的很开。想请教各位老师，这种情况可能是什么原因，我做了抗体titration的，不同浓度的抗体也没有发现有任何变化。二是我实在没有办法就将十字画在刺激过后能有明显活化的区域，因为使用的是Bcell 特意的 刺激剂anti IgD，所以认为刺激不起来的不是Bcell。这样做是否说得过去。谢谢。

niwanmao

这应该跟抗体的质量有关吧。

你可以根据同型对照（不是空白对照）来设门，这种强度分布虽然阳性和阴性之间不是隔开很大一段空白的区域，但是我觉得算是很好了。
另外，是否可以加上CD19以更有效地区分和鉴定出B淋巴细胞？

renping_jsnj

niwanmao 发表于 2012-10-12 19:23

                               
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这应该跟抗体的质量有关吧。

你可以根据同型对照（不是空白对照）来设门，这种强度分布虽然阳性和阴性之间 ...

谢谢倪老师。
我们最开始也用的是CD19，但这种刺激方式会导致CD19的分群反而不明显了，可能是CD19也参与了anti-IgD与受体的结合吧，导致最后标记抗体与之结合的少了。

niwanmao

renping_jsnj 发表于 2012-10-16 08:21:08

                               
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谢谢倪老师。
我们最开始也用的是CD19，但这种刺激方式会导致CD19的分群反而不明显了，可能是CD19也参与了anti-IgD与受体的结合吧，导致最后标记抗体与之结合的少了。

难道你的cd19是IgD来源？一般交叉结合很少吧

renping_jsnj

niwanmao 发表于 2012-10-16 17:09

                               
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难道你的cd19是IgD来源？一般交叉结合很少吧

是IgG。但是在实验当中确实是观察到这个现象，antiIgD的剂量提高，CD19的分群越来越不明显，严重时甚至分不开。用antiIgM刺激没有这样的问题。具体的原因我也不清楚，上面提到的只是推测。

另外，我订了B220的isotype control，确实需要用它来区分非特异染色，谢谢您的提醒。

niwanmao

renping_jsnj 发表于 2012-10-17 14:02:16

                               
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是IgG。但是在实验当中确实是观察到这个现象，antiIgD的剂量提高，CD19的分群越来越不明显，严重时甚至分不开。用antiIgM刺激没有这样的问题。具体的原因我也不清楚，上面提到的只是推测。

不知道这个问题在免疫学上是否可以解释？会不会两者存在交叉结合的位点？得找找资料看