新人报到，流式试验中遇到的问题

仙人掌529

新人报到，初涉流式技术，实验中遇到一些问题，特来请教，问题有点多，希望各位老师能帮一下忙，不胜感激！



问题1：实验的目的细胞是人外周血淋巴细胞，1ml全血3000转离心，全血分层，吸中间一层白色的淋巴细胞层，也会混有很多红细胞。然后先染色后裂解红细胞的。染色时间是20-30min，然后用氯化铵配的红细胞裂解液，混匀器混匀几分钟至清亮时停止裂解。请问：我在混匀的时间里，抗体和目的细胞都还在，这样会不会变相延长了抗体孵育时间？


问题2图1是BD的FACSDiva Version 6.1.3软件所呈现的图，图2是fcs在flowjo上打开的图，可是淋巴细胞分群不明显，不知道在flowjo上该设哪部分为淋巴细胞的gate？

题3：我做的是三色抗体，其中有两种是FITC和PE，我做FITC单标时，发现在两坐标轴分别是FITC和PE时，图上出现部分细胞是“双阳”的（如图3）。虽然我查了一下发现FITC荧光是有一部分会被PE通道摄取，可是图上看到的是太明显了，如果调补偿，如果为了追求“双阳”部分消失，就会出现FITC单阳的那部分补偿过度，应当如何取舍，或者如何调节使统计时不计入这群“双阳”的细胞？
（而且这群细胞又好像是在对角线上，会不会是死细胞？可是只有这两种荧光组合时的图上才有这群细胞，而APC单标时，APC和PE组合上就没有这群细胞。）

niwanmao

1、裂解的时候由于裂解液体积非常大，而且裂解液的配方与PBS不同，不适合抗体反应，所以可以忽略这种担忧：）。

2、如何设门，就得对这类细胞的特征事先了解，看下图，一图胜千言：

FSC－SSC各类细胞

3、想排除这类死细胞造成的非特异性荧光，首先尽可能使门圈中状态好的细胞，其次可以加用7-AAD或PI等染料，将死细胞排除掉。对于你这些已经做好的数据，可以试试把门圈小一点。

仙人掌529

niwanmao 发表于 2012-10-26 12:32

                               
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1、裂解的时候由于裂解液体积非常大，而且裂解液的配方与PBS不同，不适合抗体反应，所以可以忽略这种担忧： ...

谢谢站长解答我的疑惑，给我宝贵的指导。看了您的分析，我很开心。
站长，您好。不好意思，我还有个疑问：
针对问题3，如果是死细胞的话，当其他抗体单标时，所呈现的图形上也会出现这群死细胞吗？
如果不是死细胞的话，图3是我已经将FITC-PE的补偿值调到25时的图形，我试过调到80，这群“双阳”细胞就消失了，但是FITC单阳的细胞就会出现补偿过度。应该怎么办？如何正确处理这群“双阳”的细胞才能不影响最后数据的可靠性？
初涉流式技术，需要学习的东西很多。麻烦您了。

niwanmao

仙人掌529 发表于 2012-10-26 19:28

                               
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谢谢站长解答我的疑惑，给我宝贵的指导。看了您的分析，我很开心。
站长，您好。不好意思，我还有个疑问 ...

补偿调整到80是可以调下去，但是已经属于过度补偿了，所以是不正确的。
正确的做法是用7-AAD等染料排除。