破膜前后染色对结果的影响

liuxin

众所周知，我们在做CD4、CD25、Foxp3这样组合的染色的时候都是这样操作的：先染表面抗体CD4和CD25，然后破膜，再胞内染色。大家对先破膜，然后一起染抗体有什么看法。欢迎发表意见。

niwanmao

这个还确定没有对比过，但从理论上说，由于破膜剂对细胞的FSC、SSC影响很大，而且可固定表面抗原位点，所以我担心会对表面抗原的结合产生影响。

@liuxin 你做过这两种方法的对比吗？

nsync4

先抢答一下，呵呵。
到目前为止，做过胞内和核内抗原检测，胞浆抗原用的是贝克曼公司的透膜剂，胞核抗原TdT等用过Biolegend和ebioscience的。个人感觉，胞浆抗原检测透膜后再标抗体，对细胞影响不是太大，细胞体积会稍变小，SS也会变低。但做细胞核抗原，对细胞体积影响较大。

liuxin

niwanmao 发表于 2012-11-21 20:00

                               
登录/注册后可看大图

这个还确定没有对比过，但从理论上说，由于破膜剂对细胞的FSC、SSC影响很大，而且可固定表面抗原位点，所以 ...

目前还没有，只是一次检测发现细胞分群（FSC/SSC）不是很好，就在阴性标本中加入了CD45后看看到底是不是分群有问题，CD45可以染上确定无疑，而且也不是很低，但就突然想到问什么我们必须在破膜前加其他的染料，要是一起加岂不是省时间。 因此，拿出来讨论一下。

niwanmao

liuxin 发表于 2012-11-22 23:25

                               
登录/注册后可看大图

目前还没有，只是一次检测发现细胞分群（FSC/SSC）不是很好，就在阴性标本中加入了CD45后看看到底是不是 ...

我仔细想了想，觉得可以查看一下该抗原的结合位点是在胞内还是胞外，如果只在胞外，那么一般是没有问题的，因为有时候多聚甲醛固定后也做胞膜标记的，固定剂的成分应该差不多; 但是如果结合位点胞内胞外都有（例如cd3），那么可能会使表达偏强，影响结果判断。举个例子，临床上碰到皮质t细胞一般表面cd3阴性，如果像你说的这样做肯定阳性，那么你认为这个阳性属于胞内的还是胞外的？

niwanmao

liuxin 发表于 2012-11-22 23:25

                               
登录/注册后可看大图

目前还没有，只是一次检测发现细胞分群（FSC/SSC）不是很好，就在阴性标本中加入了CD45后看看到底是不是 ...

不好意思，刚才在手机客户端操作时，想点击回复，谁知点到了删除，把你回复nsync4的帖子误删了。

liuxin

nsync4 发表于 2012-11-22 21:33

                               
登录/注册后可看大图

先抢答一下，呵呵。
到目前为止，做过胞内和核内抗原检测，胞浆抗原用的是贝克曼公司的透膜剂，胞核抗原TdT ...

恩，学习了，胞内的没有做过，但是做过核内的，确实是细胞的SS和FS有很大的变化，尤其是粒细胞的FS变得比单核细胞还要小，比淋巴略大一点。@nsync4  @niwanmao

niwanmao

liuxin 发表于 2012-11-23 09:22

                               
登录/注册后可看大图

恩，学习了，胞内的没有做过，但是做过核内的，确实是细胞的SS和FS有很大的变化，尤其是粒细胞的FS变得比 ...

最好还是老老实实按照先胞膜，再固定、破膜，标记胞内的方法。因为有些标记万一是跨膜表达，而抗体又是胞膜胞内均看结合，这是就对你的结果判断产生麻烦了。

laikete

我现在染Foxp3的时候经常会遇到一个问题：就是染完后，总是发现表面CD25会掉很多，用的是ebioscience的试剂，不知道怎么改进

niwanmao

laikete 发表于 2012-12-11 17:31:28

                               
登录/注册后可看大图

我现在染Foxp3的时候经常会遇到一个问题：就是染完后，总是发现表面CD25会掉很多，用的是ebioscience的试剂，不知道怎么改进

你是指破膜后比破膜前降低很明显？会不会跟破膜剂有关？