有关流式做过信号通路分子检测的问题

samly0

请问有谁用流式做过信号通路分子检测的？最近想用流式检测的PI3K/AKT信号通路的活化水平，有没有方法介绍的？

laikete

samly0 发表于 2012-12-12 10:53

                               
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你好，我想请教下，流式做信号通路分子检测用的样本标记方法、流式检测软件和分析软件跟做普通胞膜表面抗 ...

是这样的，流式检测例如AKT这些磷酸化蛋白，是需要固定打孔细胞的，固定打孔的方法没有统一的，如果你买直标的抗体，比如BD的，他们会有试剂盒，里面包含固定打孔液，如果是普通能做流式的western抗体，就需要试一下固定打孔方法，比较麻烦，我用的是PFA和甲醇固定打孔（具体方法你需要的话我可以告诉你，不过不一定work）还有的人会用ebioscience的foxp3固定液固定，每个人做的都不一样。
流式检测和分析都是一样的，但是有几点需要特别注意的：
1.测磷酸化表达的分子一般是要刺激的，不同细胞有不同的刺激方法，时间点也不一定；
2.间标染色一定要设好对照：刺激的和不刺激的，只加一抗不加二抗，只加二抗不加一抗，一二抗都加，isotype等等，以排除一切非特异染色。

PS:如果你是一般的细胞，没有直标抗体的话，就用western检测吧，方便，稳定；如果是想分析特别小群体的细胞（如Treg），可以考虑流式染色

niwanmao

PI3K/AKT通路大部分都还是用Western blot来检测的。
不过这些通路多数都是通过磷酸化完成的，所以如果通过流式检测，还是通过蛋白磷酸化的水平来反映，我自己没测过，但看过相关文献，感觉还是有点难度的，请参见：
流式细胞术检测惰性B细胞淋巴瘤的磷酸化异常
Unit 7.27 组蛋白H2AX的Ser-139的磷酸化检测

转播微博[tthread=fangsheng7, 深深深深几许丶]http://app.qlogo.cn/mbloghead/f8703c02a0d256d01010[/tthread]

samly0

niwanmao 发表于 2012-12-10 20:20

                               
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PI3K/AKT通路大部分都还是用Western blot来检测的。
不过这些通路多数都是通过磷酸化完成的，所以如果通过 ...

哦，谢谢倪老师

laikete

我做过PI3K/AKT通路的流式检测，一般是用western检测磷酸化表达，但是流式也很方便，而且在分析小群体细胞的情况下只能用流式检测，不知道你具体要什么方法，可以买直标的流式抗体，也可以用western抗体做（一抗二抗）（还要看这个抗体能不能用来做流式）。

samly0

laikete 发表于 2012-12-11 17:26

                               
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我做过PI3K/AKT通路的流式检测，一般是用western检测磷酸化表达，但是流式也很方便，而且在分析小群体细胞 ...

你好，我想请教下，流式做信号通路分子检测用的样本标记方法、流式检测软件和分析软件跟做普通胞膜表面抗原或胞浆分子的检测有什么不一样的地方，需要在哪个环节注意些什么问题?

samly0

laikete 发表于 2012-12-13 09:23

                               
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是这样的，流式检测例如AKT这些磷酸化蛋白，是需要固定打孔细胞的，固定打孔的方法没有统一的，如果你买 ...

哦，明白了，非常感谢您的宝贵经验分享，那我先上网查看看哪家公司有我想要的直标抗体和试剂盒