流式分选细胞刺激增殖问题请教

anlilifescience · 发表于 2013-1-8 18:22:07

流式抗体标记分选T细胞后，刺激增殖；个别孔增殖异常快，我用肽刺激一般增殖比例在5%以下，但个别空会飙到50%以上，显然不是正常处理导致的。
结果不靠谱，郁闷啊，是细菌/真菌污染还是怎么回事啊？
求高人指点。。

niwanmao · 发表于 2013-1-8 21:12:42

测什么指标？CFSE？
可能是细胞状态不佳造成的非特异性染色吧，能贴几张图片或者数据吗？

anlilifescience · 发表于 2013-1-8 22:02:24

niwanmao 发表于 2013-1-8 21:12

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测什么指标？CFSE？
可能是细胞状态不佳造成的非特异性染色吧，能贴几张图片或者数据吗？ ...

图片1是第一次，刺激增殖超过50%；
图片3是第二次，刺激增殖小于5%；第二次仅有一例超过50%，图没在上面，我感觉不可信；
不知道为什么两次结果差别这么大。
的确是不同的人的样本，但这个差别显然不可信

anlilifescience · 发表于 2013-1-8 22:04:20

niwanmao 发表于 2013-1-8 21:12

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测什么指标？CFSE？
可能是细胞状态不佳造成的非特异性染色吧，能贴几张图片或者数据吗？ ...

用的是另外一个增殖染料代替CFSE，Alexa670，但原理差不多

niwanmao · 发表于 2013-1-8 22:34:22

anlilifescience 发表于 2013-1-8 22:02

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图片1是第一次，刺激增殖超过50%；
图片3是第二次，刺激增殖小于5%；第二次仅有一例超过50%，图没在上面 ...

这种增殖模式我不太清楚，似乎CFSE检测时一般中间都会有几个子代连接着的，这个似乎直接就是最后一代的感觉。那么你们平时应该测到过正常的吧？正常增殖的标本父代和子代也是这样分布的吗？

anlilifescience · 发表于 2013-1-9 08:08:57

niwanmao 发表于 2013-1-8 22:34

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这种增殖模式我不太清楚，似乎CFSE检测时一般中间都会有几个子代连接着的，这个似乎直接就是最后一代的感 ...

不是的，有时候增殖峰没那么好看哈，有CD3/28刺激的分群比较好的，附上一张图：

anlilifescience · 发表于 2013-1-9 08:34:29

Alexa670 dye和CFSE原理一样，都是连到胞内蛋白的primary amines上，随细胞分裂荧光平均分给子代细胞，是替代有GFP或荧光冲突时用的染料。

niwanmao · 发表于 2013-1-9 13:44:35

anlilifescience 发表于 2013-1-9 08:08

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不是的，有时候增殖峰没那么好看哈，有CD3/28刺激的分群比较好的，附上一张图： ...

这个系列的图确实漂亮。

如果正常的如此正常，那么这个飙升的只能高度怀疑污染了，见附件的第19页－－

使用流式中文网资料阅读器在线阅读，免流星，内容与附件完全一样（使用说明）

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（如图片无法正常显示请复制链接：http://www.flowcyto.cn/bbs/reade ... OmPCQMcGJUv70DxOnhY）

◢如确实需要下载附件，请见：

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anlilifescience · 发表于 2013-1-9 14:41:24

niwanmao 发表于 2013-1-9 13:44

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这个系列的图确实漂亮。

如果正常的如此正常，那么这个飙升的只能高度怀疑污染了，见附件的第19页： ...

谢谢您的资源分享，我感觉我似乎找到原因了：第一次分选的时候染色加了CD3和CD8单抗来分选CD8（这样可以去掉NKT。。）结果弄巧成拙，抗CD3抗体可能预先活化了T细胞，导致后面辅以肽刺激时表面看来增殖能力很强；第二次分选没有加CD3抗体，仅加了CD8抗体来分选CD8 T细胞，这样T细胞的增殖才是真正抗原特异性增殖，所以很低。
您帮忙分析一下是不是这个原因？

niwanmao · 发表于 2013-1-9 22:10:40

anlilifescience 发表于 2013-1-9 14:41

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谢谢您的资源分享，我感觉我似乎找到原因了：第一次分选的时候染色加了CD3和CD8单抗来分选CD8（这样可以 ...

有可能。验证下试试：）

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