BrdU掺入试验详细步骤

niwanmao

标题：BrdU掺入试验详细步骤（倪万茂译自华盛顿大学STEWART实验室相关资料）

第1天

1. 用100μM的BrdU工作液（用5mg/ml的储存液以6μL/mL稀释而成）标记细胞。
   Ø胚胎干细胞，30分钟
   Ø3T3细胞，2.5小时
   Ø二倍体成纤维细胞，4－6小时
2. 胰酶消化细胞，用PBS洗脱，400×g或1700rpm离心5分钟，去上清，加入10 mL 70\% EtOH重悬。
3. 保存在－20℃过夜或数天。

第2天

1. 将第一天的标本离心去上清，并用洗涤缓冲液（PBS + 0.5\% IFS）洗涤。
2. 离心去上清，以0.5 mL 2M HCl + 0.5\% IFS （必须新鲜配制！），室温孵育20分钟。
3. 加入1ml洗涤缓冲液洗涤细胞。
4. 离心去上清，以0.1M的四硼酸钠（Na₂B₄O₇）重悬细胞，室温孵育2分钟。
5. 用1ml洗涤缓冲液洗涤细胞2次（分出一部分细胞用于PI单染，见第10步）
6. 用50μL洗涤缓冲液重悬细胞，加入anti-BrdU抗体（小鼠来源），4℃孵育20分钟。 
7. 加入1.5ml洗涤缓冲液洗一次。
8. 用50μL洗涤缓冲液重悬细胞，加入抗小鼠的二抗（如FITC-conjugated rabbit anti-mouse (F(ab')2 fragments等），4℃孵育20分钟。
9. 加入1.5ml洗涤缓冲液洗涤一次。
10. 以0.3ml PI（10μg/ml）重悬细胞，室温孵育30分钟。
11. 准备上机。

椴树

老师，第八步封闭抗体为什么还要带荧光？

niwanmao

椴树 发表于 2014-8-14 11:51
老师，第八步封闭抗体为什么还要带荧光？

是原文以前写错了，于是翻译也错了。发现他们现在也更正过来了：）
http://www.stewartlab.net/Protocols/Brdu_Incorp_1.htm