小鼠Naive细胞分选遇到问题啦

木石织梦

大师们好，小妹最近在做小鼠的naiveT细胞就是CD4+CD62+磁珠分选，用的是小鼠脾脏和淋巴结，Ficoll分离单个核细胞后，阴性选择分离CD4+ 再阳性选择分离出CD62。活力都是95%以上的，有个问题是，阴性选择分离出的CD4+细胞比例较低，不到80%，阳性选择的CD62+比例能达到95%左右。我想问的是，阴性选择的比例比较低，是不是因为我在抗体孵育后没有洗涤就加了磁珠的关系吗？还是另有原因？请高人，或者有遇到相同问题的同仁们一起帮我看看会是其他的什么原因吗？

niwanmao

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olivezhou0716

用的是130-093-227？
这个没关系，说明书也建议不用洗。你的细胞起始量多少，用的什么柱子？是不是超过了柱子的最大滞留量？磁珠和抗体都分别加了多少？有没有流式图发一下看看还有操作步骤？

木石织梦

细胞量都在柱子的范围内，磁珠和抗体也是在说明书范围内，具体的量我不记得了，protocol在我师兄那里。那么，还想问下，在过柱子之前的洗涤非常必要对吗？还是也可以不用洗？会不会因为在过柱子之前没洗，导致非特异的磁珠或者抗体结合导致的本该结合细胞的柱子上的位点被占据？

olivezhou0716

过柱前的步骤是细胞与磁珠进行孵育，在设计中磁珠的量都是要过量一些的，如果不洗涤游离的磁珠会结合到分选柱上，导致柱子的无效占位，回收率会再下降。

木石织梦

olivezhou0716 发表于 2013-5-7 11:09

                               
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过柱前的步骤是细胞与磁珠进行孵育，在设计中磁珠的量都是要过量一些的，如果不洗涤游离的磁珠会结合到分选 ...

好的，看来洗涤还是很重要，我重新做一次试试看。非常感谢！