全血流式一些问题

liyi881228

本人最近开始做流式，遇到一些问题，特来请教，先谢谢大家了～
1、50uL 全血加多少抗体合适，买了BD和Biolegend的抗体，BD的抗体基本上CD3,CD8等都要加20uL，个人觉得加多了太浪费，因为样本还要做单标调补偿，所以我只加了1uL，但是貌似效果不太好，柱状图显示的峰都不完整，阳性的也没有出来两个峰只是往右偏移了，有的单标的阳性率和三标样本的阳性率相差还蛮多的，比如PD1，单标的样本比例为17%，CD3,CD8,PD1三标样本PD1阳性率只有5%，是不是我样本处理的不好的缘故？所以想请教，50uL全血，三标样本和单标调补偿样本加几uL抗体合适

2、如果要测CD3,CD8,PD1,CTLA4四个指标，但我们的仪器一次最多只能检测三个比如CD3,CD8,PD1，那CTLA4要怎么检测，是单染CTLA4还是要三色标记CD3,CD8,CTLA4？必须要做单染调补偿吗，如果每次检测多份不同人的血标本，每份血标本都需要做单染调补偿吗，还是第一份做单染调补偿后，其他的就不用调了？
CD3-FITC,CD8-ECD,PD1-APC,CTLA4-PE

liyi881228

3、细胞洗脱液和Cell Staining Buffer说的是一种东西吗，自己配制的话用PBS可以吗，PBS里面需要加血清吗，还是要加BSA，具体浓度是多少呢

niwanmao

1、如果你要用50ul全血，那么至少半量还是需要的，尤其是象你买的全量20ul的话，血的体积可能还得减少。用1ul实在是太少了，出不来是正常的。
2、如果要测4个指标，CD3、CD8是都需要用来设门的，那么就需要做两管CD3、CD8、PD1；CD3、CD8、CTLA4。单染调补偿一批标本只需做一次即可，第一份调好基本上都差不多的。

另外，我看你的图，似乎你很严格地把荧光设置在10E1以内，这样没有必要，而且容易把很多细胞都调到坐标轴外，建议你把阴性峰调到靠近10E1的位置。

liyi881228

niwanmao 发表于 2013-8-27 11:46

                               
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1、如果你要用50ul全血，那么至少半量还是需要的，尤其是象你买的全量20ul的话，血的体积可能还得减少。用1 ...

倪老师，你好，我想问一下，阴性峰像您说的调到靠近10E1的位置，是根据什么来判断呀，是看阴性峰的完整程度吗，是让阴性峰以完整的峰形出现在10E1附近是吗

Helen

虽然我现在没有涉及到做全血这一部分，但我用的Beckman和Biolegend的抗体，都是减半（10ul）来做的，效果和20ul没有什么差别。我做的样本是免疫细胞，希望可以帮到你。

niwanmao

liyi881228 发表于 2013-8-28 17:20

                               
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倪老师，你好，我想问一下，阴性峰像您说的调到靠近10E1的位置，是根据什么来判断呀，是看阴性峰的完整程 ...

就是让阴性部分曲线完整的呈现在0轴外即可，从你这个宽度看，我觉得要让阴性部分的曲线完全呈现出来，峰值这个位置可能会靠近10E1，所以这么说。

niwanmao

Helen 发表于 2013-8-28 20:43

                               
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虽然我现在没有涉及到做全血这一部分，但我用的Beckman和Biolegend的抗体，都是减半（10ul）来做的，效果和 ...

BD和BC的抗体我都用半量，一些效价高的（如CD138 PE等）甚至减至1/4。
但是楼主这个剂量减得太厉害了，至少得验证过跟全量差不多，才可放心减量。

judy006

倪老师说的没错，很多流式抗体是可以减半，甚至1/4来用的，无论品牌。但需要提前做过验证实验，发现没有区别才可以。楼主的量减的太猛了，做不出来很正常，建议提前做验证实验试一下。

didi_zhou

3色？你用的是Calibur么？通道都是些什么？貌似你的荧光素用得不对啊。

zark_00

抗体量一般用 0.5-2ug/百万个目标细胞吧 好像，按抗体浓度，计算用量