本帖最后由 Beckman6029 于 2013-12-17 20:27 编辑
各位老师好！ 在做流式凋亡检测过程中遇到些问题， 我先将具体实验步骤设计和结果交代下：
实验步骤： 同时进行四组实验 第一组：细胞未进行任何处理（未给药），贴壁细胞培养72h后经吹打后离心，直接使用D-Hanks缓冲液重悬后上机检测（未使用凋亡试剂盒）。以用来调整FL1和FL3电压，摸清荧光背景值。 注：考虑到胰酶消化不当会使得细胞损伤甚至死亡，而本实验用到的细胞培养到48-72h（密度较大）时可以比较容易用枪吹打下来。故选择直接使用1ml枪吹打下来进行后续操作。
第二组：细胞未进行任何处理（未给药），贴壁细胞培养72h后经吹打后离心，按凯基凋亡试剂盒（货号：KGA107）说明书进行染色操作，后上机检测【孵育至上机过程均注意避光】。
第三组：接种24h后对细胞进行药物A处理48h，贴壁细胞经吹打后离心，按凯基凋亡试剂盒（货号：KGA107）说明书进行染色操作，后上机检测【孵育至上机过程均注意避光】。
第四组：接种24h后对细胞进行药物B处理48h，贴壁细胞经吹打后离心，按凯基凋亡试剂盒（货号：KGA107）说明书进行染色操作，后上机检测【孵育至上机过程均注意避光】。
四组实验上机条件一致，均计数2万个细胞，电压及其他参数设置也均一致。
实验结果：
图中对应详细数值 | | | | | | | 第一组 | 69.99% | 0.01% | 0.01% | 99.98% | 0.00% | | 第二组 | 81.11% | 3.72% | 1.57% | 93.47% | 1.25% | | 第三组 | 84.59% | 10.46% | 5.77% | 80.94% | 2.83% | | | | | | |
由于本人是新手，对于本次实验存在以下问题，望各位老师能帮我分析分析：
1、 从流式细胞图和表相关数值来看，不知道凋亡试剂盒的两种染料Annexin V-FITC和PI是否成功着色？ 2、 作为阴性对照组的第二组，为什么死亡和凋亡均存在且比例不小，难道是由于细胞培养了72h密度较大的缘故，细胞自然凋亡了？但是药物需要作用那么长时间，且细胞接种密度也挺稀的。不知道具体是什么原因，有何好解决办法？ 3、 从第一组的流式图和表相关数值来看，不知道现在使用的FL1和FL3的电压值是否恰当。 4、 FL1和FL3流式细胞峰值图中，不同颜色峰代表什么意思，例如第三组的FL1峰值图中，绿色的大峰下面为什么会有一个红棕色的小峰，且该红棕色的小峰较第二组（对照组）大很多。 5、 如果本实验一切条件都没有问题，那从流式细胞结果图和数值可以得到何结论？
万分痛苦中，各位老师能提供些雪中之炭。这里有一声谢谢！！
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发表于 2013-12-17 20:25:18
发表于 2013-12-17 20:25:19
