细胞表面抗原检测 同型对照出阳性峰

椴树

转染293T细胞，检测该质粒表达的蛋白在细胞膜表面的表达情况。步骤：PBS洗后，用0.05%EDTA Na2 （PBS 配）37°消化，吹打，离心，按美天旎的说明书10e6的细胞45ul stain buffer（0.5%BSA 2mM EDTA PBS） 加5ul同型对照或实验抗体，冰箱4°孵育10min后加600ul stain buffer 4度离心后，用stain buffer洗2次，上机。我转染的293T表达红色和绿色荧光蛋白，我用的抗体是APC直标的。我想问：1.为什么我的同型对照也出了阳性峰？

2.我有同学没用同型对照但是用的封闭抗体处理的样品再染目标蛋白，二者有何优劣？
3.检测有无表达的话，用同型对照，一般是把2个峰图叠加到一起，看目标蛋白染色的峰图相对同型对照右移的程度，我想问这种叠加的图有流式软件直接叠加么？还是大家都用Photoshop叠加呢？

niwanmao

你要测的是什么标记？是否本来就非特异性荧光高？
从阳性组看，FSC/SSC和结果十分接近，是否可能两个标本都是阳性组？

dragonhzqsmmu

G1的圈门是否过大？你待测的细胞是否右边这一群细胞？把G1的门缩小到右侧，再来看APC表达情况看看？

封闭是否假阳性率会更低点？

叠加一般使用流式细胞软件诸如flowjo等进行，论坛里面有类似的软件，或者用免费的winMDI也行的

椴树

dragonhzqsmmu 发表于 2014-6-25 21:58
G1的圈门是否过大？你待测的细胞是否右边这一群细胞？把G1的门缩小到右侧，再来看APC表达情况看看？

封闭 ...

谢谢 我试了下 G1圈主要的那团细胞 出来的峰都是2个 没变化。G1圈左边一团的话，出来的峰差不多都是阴性峰，阳性部分一个小小的拖尾。我不知道为什么会出现这么多细胞团，我不做处理用来调电压的293T也是这么多团，我觉得可能是我消化细胞的时候出了问题，我们没有EDTA所以我用了等摩尔量的EDTA Na2 H2O来消化细胞，同样的293T用胰酶消化做细胞周期的时候就不会有这么多细胞团。我放原始文件上来，您帮我分析下可以么？（不知道回复的时候怎么放附件，我就直接放到帖子里吧），还有一个问题，什么情况下FSC/SSC图会在碎片位置出现两个对称的细胞团呢？

椴树

niwanmao 发表于 2014-6-25 19:57
你要测的是什么标记？是否本来就非特异性荧光高？
从阳性组看，FSC/SSC和结果十分接近，是否可能两个标本都 ...

单看同型对照的话，我觉得不能出来2个峰，我不知道问题出在我消化细胞上还是出在我抗体浓度太高了，但是我是按照美天旎的说明比例来加的抗体。

dragonhzqsmmu

椴树 发表于 2014-6-26 13:56
谢谢 我试了下 G1圈主要的那团细胞 出来的峰都是2个 没变化。G1圈左边一团的话，出来的峰差不多都是阴性峰 ...

这样看来是否消化细胞的问题，我们一般用accutase酶消化细胞，比较温和，细胞分群也比较清晰，或者直接用传统的胰酶消化细胞？

之前是否EDTA消化不完全导致膜的非特异性染色？

椴树

dragonhzqsmmu 发表于 2014-6-26 16:13
这样看来是否消化细胞的问题，我们一般用accutase酶消化细胞，比较温和，细胞分群也比较清晰，或者直接用 ...

EDTA消化不完全为什么会导致非特异染色呢？看文献说用胰酶的话，如果表达量高还好，如果低了，就很难检测到了吧。单纯用EDTA消化，好像好多人都都这么做，不知道别人有没有像我这样分好多群的，我明天用EDTA消化久一些看看吧。我的stain buffer自己配的，配方应该没有问题。

niwanmao

椴树 发表于 2014-6-26 16:20
EDTA消化不完全为什么会导致非特异染色呢？看文献说用胰酶的话，如果表达量高还好，如果低了，就很难检测 ...

你是否可以先告诉我们做什么标记？如果跟Fc片段有关的，建议做一个封闭试试。

椴树

niwanmao 发表于 2014-6-26 21:50
你是否可以先告诉我们做什么标记？如果跟Fc片段有关的，建议做一个封闭试试。 ...

奥 是自己表达的小鼠MHCI家族分子。我用的抗体是https://www.miltenyibiotec.com.c ... up__APC__mouse.ashx ，同型对照是mouse IgG,但是我发现我的抗原就是鼠的。1：为什么它一抗还是鼠来源的呢？为什么有mouse anti mouse的抗体呢？http://www.genwaybio.com/mouse-anti-mouse-h-2kk
2：为什么跟Fc片段有关要做个封闭呢？用什么封闭呢？
3：我用同型对照不就扣除了么？

niwanmao

椴树 发表于 2014-6-27 21:55
奥 是自己表达的小鼠MHCI家族分子。我用的抗体是https://www.miltenyibiotec.com.c ... up__APC__mouse.as ...

从这些信息看 ，我觉得你还是最好做一个Fc受体封闭，封闭的东西就在这个说明书的第2页：FcR Blocking Reagent, mouse (# 130‑092‑575) to avoid Fc receptor–mediated
antibody labeling.

同型对照只能体现基础背景。