死细胞很多，PI的值却很低

raulcoco · 发表于 2014-8-29 05:46:57

新开始一个课题

用药物处理细胞（293），用PI染色，看死细胞有多少

药物处理之后，收集细胞，50ug/ml PI浓度PI 避光染色 15分钟

直接用流式检测

检测结果，PI阳性的细胞居然 10K 中只有 8个

我这个 PI 的染色过程有什么问题吗？

多谢多西

niwanmao · 发表于 2014-8-29 08:21:11

染色问题不大，时间可以缩短为5分钟，PI浓度配制成1mg/ml，1ml细胞内加入10ul。
但是我觉得你染不上的关键可能是PI试剂有问题，否则即使浓度有问题也不应该染不上

raulcoco · 发表于 2014-8-30 01:07:01

新买的 PI，是sigma 的原装产品

Flow 的时候，还是能看到区别的

Blank 是空白组

Treatment 是给药组

flow 的原图是这样的，我觉得是设门的问题

像这样的，具体怎么设门呢？

多谢多谢

raulcoco · 发表于 2014-8-30 01:11:49

niwanmao 发表于 2014-8-29 08:21
染色问题不大，时间可以缩短为5分钟，PI浓度配制成1mg/ml，1ml细胞内加入10ul。
但是我觉得你染不上的关键 ...

染完是不是还需要用PBS 洗一遍细胞呢？

niwanmao · 发表于 2014-8-30 06:24:44

raulcoco 发表于 2014-8-30 01:11
染完是不是还需要用PBS 洗一遍细胞呢？

不用洗涤的。你圈一下treatment组左边那群看看，PI是不是阳性？

a86856635 · 发表于 2014-8-30 16:35:01

处理时间过久细胞死完了，变成碎片了

raulcoco · 发表于 2014-9-2 04:58:31

a86856635 发表于 2014-8-30 16:35
处理时间过久细胞死完了，变成碎片了

在镜下可以看到细胞圆缩

我们现在考虑的是，做sample的时候，上清都扔掉了，只用trypsin 让贴壁细胞，所以，没有那么多 PI染上的细胞？

niwanmao · 发表于 2014-9-2 20:00:46

raulcoco 发表于 2014-9-2 04:58
在镜下可以看到细胞圆缩

我们现在考虑的是，做sample的时候，上清都扔掉了，只用trypsin 让贴壁细胞， ...

跟这个应该没有关系。贴壁细胞的PI阳性率还是比较高的。我建议你试试调整PI浓度到1mg/ml试试。

raulcoco · 发表于 2014-9-4 02:05:14

niwanmao 发表于 2014-9-2 20:00
跟这个应该没有关系。贴壁细胞的PI阳性率还是比较高的。我建议你试试调整PI浓度到1mg/ml试试。 ...

1mg/ml 的原始浓度

每个1ml sample中加入 10ul 的PI

相当于10ug/ml的终浓度？

这个有什么讲究吗？我用的是50ug/ml的终浓度

多谢多谢

a86856635 · 发表于 2014-9-4 08:46:34

建议做一个时间梯度

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