流式染Th17细胞出现问题

倪shunlan

这些天做大鼠的Th细胞流式，我是从大鼠尾静脉取外周血，经淋巴细胞分离液分离获得单个核细胞后，用DMEM（也有用过1640培养基）悬浮细胞，加入莫能霉素、离子霉素刺激，在37℃，5%CO2培养箱中孵育的时候，出现絮状沉淀，细胞全都裂解掉了，一共做了7次了，每次都出现絮状沉淀，请问大家有遇到这种情况吗？请问大家在细胞孵育前有做什么特别的处理吗？谢谢！

niwanmao

加刺激剂前细胞状态是否好？我觉得会不会是你分离的时候细胞就死了。

倪shunlan

niwanmao 发表于 2014-9-24 18:16
加刺激剂前细胞状态是否好？我觉得会不会是你分离的时候细胞就死了。

加刺激剂前细胞状态，没有染台盼蓝，我觉得应该好的。因为我同一批细胞分离出来，既做了Treg，也做Th17，Treg流式做出来还好的，做的过程也没有出现絮状沉淀，Th17用“联科”的细胞因子刺激剂后孵育时就进行性出现絮状沉淀。。

niwanmao

倪shunlan 发表于 2014-9-24 21:01
加刺激剂前细胞状态，没有染台盼蓝，我觉得应该好的。因为我同一批细胞分离出来，既做了Treg，也做Th17，T ...

你这样，每加一样东西之前，取一点在镜下观察形态，可以确定究竟是哪一步的试剂出问题。

倪shunlan

niwanmao 发表于 2014-9-24 21:21
你这样，每加一样东西之前，取一点在镜下观察形态，可以确定究竟是哪一步的试剂出问题。 ...

我昨天有观察，在刚加入pma等刺激培养时，放到计数板上看了一下，细胞形态是正常的。然后把计数板一同放到培养箱培养了，2小时后，在取出计数板看，感觉细胞皱缩的很厉害，反正是镜下变小变黑了。所以感觉是加了刺激物引起的，是不是同样的刺激物对大鼠不适用啊，还是说pma等本来就质量有问题。

niwanmao

倪shunlan 发表于 2014-9-24 22:03
我昨天有观察，在刚加入pma等刺激培养时，放到计数板上看了一下，细胞形态是正常的。然后把计数板一同放 ...

可以试试换sigma的PMA看看。

倪shunlan

niwanmao 发表于 2014-9-24 22:12
可以试试换sigma的PMA看看。

嗯，谢谢老师的耐心解答！