全血和密度梯度离心法，标记内皮祖细胞流式细胞仪检测...

yamamomo

     本人刚开始接触流式，想请教：
1.用100u全血做CD133CD34双标内皮祖细胞检测，抗体的用量是多少，美天旎的说明书是10^7以下用10ul，fcr封闭试剂则是20ul，用密度梯度离心后提取淋巴细胞可以计数细胞，然后以这个量孵育，但是全血不知道是什么剂量操作。
2.另外一个问题是若用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，没有无菌操作，离出来的细胞有时候污染很重，若是不培养细胞，仍然要无菌操作么？
3. 2ml的大鼠血提取出来单个核细胞经计数大概就3*10^6细胞  但要分成4管样本 ：双标管、单标补偿2管，空白对照管，不知道这个细胞数够不够流式检测呢？
    希望老师能给与指导，谢谢！

niwanmao

1、说明书没有标明标本量，默认是针对1×10E6细胞（体积100ul）。
2、如果不培养细胞，不需要无菌操作，只要是新鲜分离的标本，不存在污染很重的问题。
3、补偿调节管和空白管只需要做一次即可，不需要每次都做。

yamamomo

niwanmao 发表于 2014-11-21 09:11
1、说明书没有标明标本量，默认是针对1×10E6细胞（体积100ul）。
2、如果不培养细胞，不需要无菌操作，只 ...

老师的意思是，体积100ul的全血差不多是1*10E6细胞，所以按说明书来就是10ul的抗体，有看到一篇文章用100u全血做只加1u的抗体，是因为说明书上10ul抗体可以标记1*10E7吗？能这样换算吗？毕竟美天旎抗体确实很贵。

老师用大鼠的全血做过cd133么？是表达很低？我做的时候基本没表达，不知道是抗体原因，还是表达实在太低了！

谢谢

niwanmao

yamamomo 发表于 2014-11-21 16:54
老师的意思是，体积100ul的全血差不多是1*10E6细胞，所以按说明书来就是10ul的抗体，有看到一篇文章用100u ...

1、是否能减量到1ul需要你进行抗体滴定（具体方法站内可以找的到），那篇文章跟你用的是否同样的抗体？有时候即使同样的抗体，也最好进行滴定。
2、CD133是很低，但取10万甚至100万个不会基本没表达。CD133应该是美天旎的拳头产品之一，应该质量不太可能会有问题，可能是标记的问题。

yamamomo

倪老师，又有问题麻烦你了。。我看别人选的cd34和133做的流式，设置R1圈单个核细胞，R2圈的cd34阳性，R3再圈双阳。问题是：1.只有2个标记的话，是不是就可以直接做双阳的散点图呢？（我自己觉得圈定34+后再找双阳准确点）2.我们设置了G1=R1，G2=R2，G3=R1 AND R2，双阳散点图关联的G3，出来的结果跟别人的不同，是R3的问题么？
对比图放附件了：1为别人做的，2为自己做的

而且出来的结果是双阳占34+的比例，能显示双阳占G1单个核细胞的比例吗，还是需要自己算呢？

niwanmao

yamamomo 发表于 2014-12-22 13:30
倪老师，又有问题麻烦你了。。我看别人选的cd34和133做的流式，设置R1圈单个核细胞，R2圈的cd34阳性，R3再 ...

你上面这个别人做的图我有点看不懂，如果是逐级设门，那么第三个不应该有CD34阴性细胞出来啊。有问题。

其实，设门如何设，问题不大，只要按照细胞表达特点设置出门就可以了。

yamamomo

niwanmao 发表于 2014-12-22 20:05
你上面这个别人做的图我有点看不懂，如果是逐级设门，那么第三个不应该有CD34阴性细胞出来啊。有问题。

...

恩，是不懂怎么出的它的这个图，所以请教一下您，谢谢。那就是直接画双阳的散点图就可以了是么？

niwanmao

yamamomo 发表于 2014-12-22 23:11
恩，是不懂怎么出的它的这个图，所以请教一下您，谢谢。那就是直接画双阳的散点图就可以了是么？ ...

可以R1圈单个核细胞，R2圈双阳性，如果分群可以，就这样好了。如果分群不是很清，可以再增加一个CD34或CD133 vs SSC的图，设置R3。