如何解决离心洗涤过程中样本丢失问题

yuemin5

各位老师：

我们需要对体系中特定的细胞进行绝对定量，设计了该细胞的特异性抗体，目前进行模拟实验。方案是：将此类细胞经细胞计数仪或者流式细胞仪绝对计数后，以不同的比例参入背景体系中（比如肿瘤细胞加入正常PBMC中），染色后评估我们设计的抗体对该群细胞的检出能力。

现在我碰到一个问题：洗涤过程会造成细胞大量丢失，特别是有胞内染色时。操作的丢失直接造成这个模型的不确定性。

请问各位老师是如何解决洗涤过程中细胞丢失的问题的？


非常感谢！

niwanmao

一般来说，即使丢失也是等比例丢失，问题不大的。不过如果确实担心细胞丢失引起准确率下降，那么可以模仿那些绝对计数项目那样，采用免洗的方法，一般是100ul体积染完色，加入900ul或1900ul裂解液，裂解10分钟，如果不需要裂解，此处就加入900ul或1900ul PBS，直接上机。

yuemin5

倪老师，关键是我要做绝对数，不是相对比例。我可以考虑下免洗的方法。

niwanmao

yuemin5 发表于 2014-11-28 13:26
倪老师，关键是我要做绝对数，不是相对比例。我可以考虑下免洗的方法。

那最好是免洗方法。

yuemin5

@niwanmao 我们用Beckman的破膜剂没有洗涤，能染出来。 但是我突然想到一个很白痴但是很重要的问题，如果一种细胞百分百表达抗体A，但背景细胞零表达抗体A，能否用A抗体的表达百分比表示此种细胞在背景细胞中的数量百分比？ 谢谢倪老师

niwanmao

yuemin5 发表于 2015-1-5 17:41
@niwanmao 我们用Beckman的破膜剂没有洗涤，能染出来。 但是我突然想到一个很白痴但是很重要的问题，如果一 ...

你指的是表达A抗体的细胞在所有细胞（A+细胞和背景细胞之和）中的百分比吧，我觉得这个时候表达百分比应该就=数量百分比啊

yuemin5

niwanmao 发表于 2015-1-5 19:04
你指的是表达A抗体的细胞在所有细胞（A+细胞和背景细胞之和）中的百分比吧，我觉得这个时候表达百分比应 ...

恩，是这个意思。我只是想到一个是数量百分比，一个是荧光强度百分比，突然有点疑惑。明天做出来看看就清楚了。谢谢倪老师。

niwanmao

yuemin5 发表于 2015-1-6 08:14
恩，是这个意思。我只是想到一个是数量百分比，一个是荧光强度百分比，突然有点疑惑。明天做出来看看就清 ...

我们平时分析出来的百分比就是数量上的百分比啊，荧光强度只是有时候用来进行比值计算用。

dcl60066

请问免洗对最后的结果是否有影响吗，最好有染色后不染色的对比

niwanmao

dcl60066 发表于 2015-1-16 16:35
请问免洗对最后的结果是否有影响吗，最好有染色后不染色的对比

免洗时主要还是通过大体积的稀释来减少那些未结合抗体的影响，最后的体积大一点，应该可以忽略。