求解---标记过程中细胞裂解，上机检测时已无细胞

向前

1、我的抗体孵育液用的0.01M的PBS，固定用的4%的多聚甲醛，穿膜用的0.3%的tritionx-100, 离心是贝克曼microfuge^R的1500r,5min.
不知道什么原因，每次操作后就会少很多细胞，尤其是穿膜后，几乎就没有细胞了。固定剂及穿膜剂和细胞的浓度比例有影响吗？一般的比例是多少？
2、在标记前用正兔血清封闭细胞也没有了，血清浓度为5%。血清来源：兔全血离心直接取上清后用PBS稀释至5%。

ddn111

0.3%的tritionx-100,浓度太高了！破膜也比较厉害，时间不好控制，换其它的如皂素（saponin）这类温和的破膜剂吧！

向前

ddn111 发表于 2014-12-9 10:12
0.3%的tritionx-100,浓度太高了！破膜也比较厉害，时间不好控制，换其它的如皂素（saponin）这类温和的破膜 ...

你们使用的条件是什么呢？谢谢！！！！

niwanmao

向前 发表于 2014-12-9 10:32
你们使用的条件是什么呢？谢谢！！！！

如果染胞内标记，建议要么用皂素，要么用商业化破膜剂，其他的破膜剂对细胞膜破坏太大。

君子兰

你描述的这几个试剂的浓度是终浓度吗？多聚甲醛作流式的时候比较常用1%（终浓度），但4%也有人使用。Triton X-100 0.3%的终浓度也还是可以接受的，只是时间要控制好，不宜太长。你破膜后几乎就没有细胞，我考虑你是不是没有用缓冲液（PBS）来配置这两种试剂，以致细胞裂解了。

向前

君子兰 发表于 2014-12-10 02:27
你描述的这几个试剂的浓度是终浓度吗？多聚甲醛作流式的时候比较常用1%（终浓度），但4%也有人使用。Triton ...

谢谢您的回答。我用的多聚甲醛终浓度时4%的，固定10分钟，triton x-100终浓度是0.3%，加入这两种液体的体积和细胞数量有关吗？

君子兰

向前 发表于 2014-12-11 08:16
谢谢您的回答。我用的多聚甲醛终浓度时4%的，固定10分钟，triton x-100终浓度是0.3%，加入这两种液体的体 ...

这个我没查相关资料。一般上流式的细胞浓度控制在每毫升10的5次方到7次方个细胞比较好。