直方图中只有一个峰，如何设门？

土蚂蚁

大家好！最近刚学流式，还没入门。有个问题请教一下：我现在分析的是小鼠模型治疗几周后的肥大细胞（CD45CD117），问题如下：要找到此双阳性细胞，一般先是在CD45单染和CD117单染里先画门。但是从附件的单染图（主要看CD45和CD117。其他的抗体与肥大无关，是我同时标记看其他细胞的）中来看，CD45及CD117的直方图一般应该都应该能找出阳性群（荧光值更高）和阴性群两个峰，但是我的图里很多直方图几乎都只有一个峰，CD45直方图似乎只见阳性群，没见阴性群。而CD117直方图只见阴性群，而无阳性群（是否可能是肥大细胞主要是早期致病起作用，在治疗数周后的这个阶段已经几乎没有了）。请问是什么原因呢，这种情况下，又如何设门？如何才能找到肥大细胞？


周末快乐，谢谢！

小小研究生

等待结果，我也是新手。{:soso_e181:}

小小研究生

你这边细胞单一，你应该把所有的细胞都圈进去

土蚂蚁

小小研究生 发表于 2014-12-27 15:45
你这边细胞单一，你应该把所有的细胞都圈进去

就是说物理图中应该所有都圈进去吗？我原来那69.7%的范围是技术员上机时帮圈的，是不是圈小了？

土蚂蚁

再补充一张CD45CD117的双参图，似乎也不好找双阳性

土蚂蚁

刚才继续看了下资料，物理图细胞群分布不清楚，是否可能是样品染色和保存时间影响（如下图）？
但是，昨天咨询了技术员，他说单个核细胞在人血和PBMC中是有明显分群，但脾细胞（我们的样品）一般分群都不明显。
所以目前考虑，是不是很可能是肥大细胞在发病后期已经很少，也就不能成群。

但问题是，CD45为什么也只有一个峰呢?典型的CD45不应该是双峰吗，一个低染，一个峰高染？这种情况，如何圈门？

niwanmao

土蚂蚁 发表于 2014-12-27 16:20
再补充一张CD45CD117的双参图，似乎也不好找双阳性

像你的结果应该如下图设双阳性，不过也不能排除干细胞可能吧，干细胞的CD45也是弱到中等表达：

土蚂蚁

niwanmao 发表于 2014-12-27 22:06
像你的结果应该如下图设双阳性，不过也不能排除干细胞可能吧，干细胞的CD45也是弱到中等表达：

老师，刚才我又看了下资料，确实可能存在干细胞的可能。所以得另外加CD34. CD34-CD45+CD117+的才是肥大。另外，一般肥大的数目可能到了病程一定阶段不太多了，是不是很可能是我画圈的地方。那群才是。而您画的，可能是干细胞群？

还有另一个问题，带ABCD那副图，我有点看不明白，在A图里，圈出的CD117+细胞还是很少，B图说设了下门，细胞显示就多了。不明白，A到B是怎么设了门，这个过程？


还有一个一直困惑的，很多的直方图，只有一个峰，怎么知道这个峰是阳性峰还是阴性？如果只有一个峰，圈门时，又怎么圈呢？我印象还见过有些单峰在X轴左边的，直接把圈门圈在右边几乎不显示荧光的地方，难道是不管高峰在哪，关键是圈右边高荧光的，哪怕几乎没见（细胞很少）。


这几个问题，纠结了两天了，老师能否一起解答。非常感谢！！！{:soso_e183:}

niwanmao

土蚂蚁 发表于 2014-12-27 22:35
老师，刚才我又看了下资料，确实可能存在干细胞的可能。所以得另外加CD34. CD34-CD45+CD117+的才是肥大。 ...

肥大细胞的CD117确实比较高，昨天画的这个门可能是干细胞。

ABCD那幅图，他们的意思是指去掉那些碎片信号后，相对来说，肥大细胞的比例就高起来了，那么获取同样数量的信号，这群细胞的量就多了。

至于分群不明显的直方图，多色实验的话用FMO，单色实验用同型对照，来划分分界线。