小鼠骨髓细胞流式分析设门问题

Lance

按照附件中文献方法分析小鼠骨髓内各类干细胞的分化，KSL群检测不到，KloLlo群不知如何界定，KL群自己做的看不到MEP细胞，不知道GMP与CMP是否正确，初做流式，fcs数据附件里可见，麻烦各位老师有时间帮忙看看。Marker: Lineage staining utilized a cocktail of biotinylated anti-mouse antibodieMac-1 (CD11b), Gr-1 (Ly-6G and 6C), Ter119 (Ly-76), CD33, CD4, CD8a(Ly-2), and B220 (CD45R) (BD Biosciences). For detection and sorting, we
used streptavidin conjugated with PE/Cy7 (BD,Biosciences). Directly conjugated antibodies used were as follows: cKitAPC (CD117) and Flk2-PE (CD135) (BD Biosciences); Sca1-PE/Cy5.5 (Ly6A/E, Caltag); and CD34-FITC, CD16/32-Alexa700, and IL-7Ra(CD127)-BDv450 (eBioscience)。
想咨询一下几个问题：
1.Lin-gated 怎么设门
2.KL门内GMP，CMP是否划分正确，为什么没有MEP
3.自己的实验和文献中的差有两个细胞群，是细胞含量太少没有还是其他的原因。
4.K-loL-lo群怎么界定比较精准。
谢谢

Wnt Signaling in the Niche Enforces Hematopoietic Stem Cell Quiescence and Is Necessary to Preserve Self-Renewal In Vivo
https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NzM1OXxkYmU0NjBiNHwxNzQwMzczMjc4fDB8


Flow Cytometry Analysis of Murine Hematopoietic Stem Cells

https://flowcyto.cn/bbs/forum.php?mod=attachment&aid=NzM1OHwwMTE1YTIzY3wxNzQwMzczMjc4fDB8

Lance

参考文献内的设门方法

niwanmao

Lin指的是一系列抗原，你的实验中指的是Mac-1 (CD11b), Gr-1 (Ly-6G and 6C), Ter119 (Ly-76), CD33, CD4, CD8a(Ly-2), and B220 (CD45R) (BD Biosciences)，这些都是生物素化的抗体，然后再加上二抗（抗生物素的PE-cy7二抗），然后圈阴性细胞群。你的数据里面没有标记这些抗体，所以没法设Lin- gate。

至于没有三群祖细胞，我觉得和两个原因有关：
1、你的标本中干细胞本身就少？
2、CD117、CD34等标记结果欠佳，是否抗体滴度没有调整好？

另外，你所说的K、L具体指什么？

Lance

niwanmao 发表于 2015-1-9 14:17
Lin指的是一系列抗原，你的实验中指的是Mac-1 (CD11b), Gr-1 (Ly-6G and 6C), Ter119 (Ly-76), CD33, CD4,  ...

Lin biotin用PE-CY7 标记了 数据里有
KLS 我猜测 K代表cKit L代表Lineage S 代表Sca
第一篇参考文献里面 有具体细胞表面标记物 在前面
第二篇参考文献 应该是和第一篇一样的方法 但是 图案不一样 文献中的细胞是富集的 可能比较多 但是我的压根就没有
老师是怎么判断抗体未标记好的 如需要我把单染样品数据也给您发过去
谢谢

Lance

我的Lin-是这样子设门的 左侧为Lin阴性 不知道是否正确

niwanmao

Lance 发表于 2015-1-9 15:28
Lin biotin用PE-CY7 标记了 数据里有
KLS 我猜测 K代表cKit L代表Lineage S 代表Sca
第一篇参考文献里面  ...

不富集，干细胞是极其稀少的，所以在你的标本里面看不出明显的干细胞，CD117几乎均阴性，见下图。


我建议你还是富集后再测吧。

至于所谓Low的圈门，其实需要首先能够像文献中的那个图一样，阳性和阴性能够明显区分开，然后圈两者之间的部分就是low了。

Lance

niwanmao 发表于 2015-1-9 15:45
不富集，干细胞是极其稀少的，所以在你的标本里面看不出明显的干细胞，CD117几乎均阴性，见下图。

倪老师，您的图我没太看懂，刚接触流式，我想问下我这样Lin-设门对不对。

Lance

niwanmao 发表于 2015-1-9 15:45
不富集，干细胞是极其稀少的，所以在你的标本里面看不出明显的干细胞，CD117几乎均阴性，见下图。

检测的是药物作用后 骨髓内细胞分化 做不到富集 即使没有HSC数据 想问下 关于 GMP和CMP的圈定是否正确 因为实验有12个样本 每个都是这样子的

Lance

niwanmao 发表于 2015-1-9 15:45
不富集，干细胞是极其稀少的，所以在你的标本里面看不出明显的干细胞，CD117几乎均阴性，见下图。

Lin- 对应Pe-CY7
Sca- Pe-CY5.5
cKit-APC
CD16/32-AF700
Flk2-PE
Il7a-V450
CD34-FITC
老师您发的第二张图 我没看懂想说明什么 我是新手 能麻烦您解释下么
              

niwanmao

Lance 发表于 2015-1-9 16:22
倪老师，您的图我没太看懂，刚接触流式，我想问下我这样Lin-设门对不对。 ...

Lin可以用直方图设，但我认为你的阴性区域不应该设在这个位置，而是更左边。
GMP和CMP可以参照参考文献的图设，问题不大。

我发的第二图是随便设了下，没有意义，只是想说明细胞不分群。