抗体孵育时细胞浓度？ISO背景偏高？

元杰5

我做的是脐带MSC，检测项包括CD105、CD90、CD34等，CD105和CD90的标准应该是95%以上，CD34则低于2%；最近这两次的检测出了些状况：
1.CD105的表达率低，CD90的倒是很正常。因为细胞浓度的原因，跟平时的操作有点小不同：平时与抗体孵育时浓度为1*10^6/ml，取200微升，这两次做的是约4*10^6/ml，取100微升。而抗体的量都是5微升，按说明书上的，5微升可以标记1*10^6细胞。除了细胞浓度，这两次的操作没有区别。
2.多次实验过程中都感觉PE同型对照的信号过高了，每次都会比阴性的CD34要高，同时CD105的信号（峰值图）也只是刚刚跟阴性分开，所以有的时候以同型对照画门，CD105达不到95%，以CD34画门却可以达到。
请问上面两个问题是怎么回事呢？有什么解决办法？

niwanmao

1、每种抗体的滴度不一样，所以需要依次进行滴定，确定最佳的染色浓度和体积，因此不能随意改变染色体积和抗体量、细胞量。注意保持每次染色细胞量和抗体量的一致。

2、所谓的同型 对照高于阴性对照，以前我在背景荧光帖子中提到过，涉及原因很多，需要一一排除：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-4181-1-1.html

ypfbluesky

记得在站内看过抗体滴度的文章，说抗体滴度更相关的是抗体浓度，而非细胞量。虽然染的是一样多的细胞量，但细胞浓度更高，体积更少的情况下，抗体量应该要减少的。但不一定减半就是合适的。所以，要么重新做抗体滴度，要么维持原来的方法。