为什么会出现同型对照荧光信号比空白对照还低的现象？

元杰5

这两天才出现的情况，细胞是间充质干细胞，抗体是Biolegend的，染色PE，如图：


图片描述（图是不是太小了？怎么弄大一点）：左边是空白对照，中间是同型对照，右边是阴性MARER（右边配的前向侧向图是错的，请无视。）
另外，同型对照上样时会先出现一段较强的荧光信号，几秒之信号强度会迅速降低；上面同型的图中，P2门内的就是上样初期出现的较强的荧光信号。
请各位大神帮忙分析一下。

niwanmao

首先，出现同型对照比空白对照低的原因比较多，最常见的就是同型对照选择错误，可能选择了不同厂家生产的同型，或者选择了不同亚型的同型。

对于第二个问题，同型对照上样前先出现一段较强的荧光信号，可以看的出来，你是先上空白对照，再上同型对照吧，说明前面那段较强的荧光信号是前面空白对照残留的标本造成的，说明的在上样前仪器液路中残留标本清除不干净，建议以后上样前先上一管蒸馏水冲洗或者等跑稳定了再保存。

元杰5

谢谢答复。但这些问题我有考虑过；1、同型对照与标记抗体是同一厂家的，也询问过产家，两者的亚型也是一样的（不过空白对照是未标记的，跟这个应该没有关系）。2、有试过排除第2个问题，比如一管同型对照，第一次上样出现荧光信号由强到弱现象，待稳定后，停止上样取出样品管，backflush冲洗，再次用同一管同型对照上样，却还是会出现上述现象。

niwanmao

元杰5 发表于 2015-3-23 09:57
谢谢答复。但这些问题我有考虑过；1、同型对照与标记抗体是同一厂家的，也询问过产家，两者的亚型也是一样 ...

同型对照和标记的抗体之间，关系其实非常微妙，厂家的人如果不是搞产品的，可能也不一定懂。如有可能，你可以把抗体和同型对照的厂家和批号都传上来我们看看。

至于上样问题，我几乎可以肯定是进样针取样问题，反冲有时候能解决，但有时候真的没法解决，建议多做几次大冲洗，实在不行，只能请工程师帮忙冲洗。

元杰5

niwanmao 发表于 2015-3-23 10:25
同型对照和标记的抗体之间，关系其实非常微妙，厂家的人如果不是搞产品的，可能也不一定懂。如有可能，你 ...

嗯，第一个问题我们再找找原因看看跟操作有没有关系；
上样的问题，为什么只有同型对照管和CD105管出现该现象呢？（CD105应该是阳性，但最近检测发现部分样品达不到标准）其他标记或阴性管都没出现或不明显

元杰5

顺便再请看一下我的分析和画门有没有问题或需要改进的

niwanmao

元杰5 发表于 2015-3-23 13:56
顺便再请看一下我的分析和画门有没有问题或需要改进的

因为同型对照有问题，所以不应该以同型对照为设门参照。

如果你是多色标记，可以改成FMO，而无需同型对照。

元杰5

niwanmao 发表于 2015-3-23 14:02
因为同型对照有问题，所以不应该以同型对照为设门参照。

如果你是多色标记，可以改成FMO，而无需同型对 ...

好的，谢谢

元杰5

还没有做过多色，到时再好好学习一下FMO

zj8237277

倪老师，您好！
因为同型对照有问题，所以不应该以同型对照为设门参照。
如果你是多色标记，可以改成FMO，而无需同型对照。

另外网站中提到：同型对照主要是反映抗体的非特异性结合背景，并且介绍了同型对照选择的几个关键因素，同时也顺便提及FMO对照。FMO对照主要用在>4色的流式检测中，由所有抗体减去一个目标抗体组成，所以能够反映荧光渗漏引起的背景荧光，在多色流式检测中非常重要。
从以上概念我们可以看出，FMO对照和同型对照反映的是两种类型的背景荧光，所以在多色流式时，要用单独使用其中一种来设门，均不可靠。

请教下，问题是：既然同型与FMO反映的是两种不同类型的背景荧光，为何这里说，做多色时，可以改成FMO，而无需同型对照？     谢谢！