CD3+T细胞分群不明显

zhang65103

  各位老师，我现在做的实验是人外周血CD14磁珠分选出单核细胞刺激活化后和磁珠阴选的CD4+T共培养，然后流式分析IL-17的表达。流式结果如下：
有几个问题不太明白，希望老师们指点：1.从图一来看细胞碎片是不是比较多，圈的门正确么？
                                                           2.图2 中的FVD是eBiosience公司的染死活细胞的染料，从这个直方图来看只有单个峰，细胞是不是没有分群?同样，图3和图4也是这种情况，细胞未分群，除了跟抗体浓度有关，还有什么因素呢？
                                                          3.图6是不同人外周些做的，实验步骤都和图1一样，怎么相差这么大呢？

  问题比较多，期待老师们的回复~{:soso_e113:}感谢~

niwanmao

1、基本上是碎片，所以结果欠佳。
2、FVD你的处理步骤是否正确？需要事先在室温下平衡一下，并且加的量是1ml细胞加1ulFVD。

zhang65103

niwanmao 发表于 2015-11-14 21:44
1、基本上是碎片，所以结果欠佳。
2、FVD你的处理步骤是否正确？需要事先在室温下平衡一下，并且加的量是1m ...

谢谢老师！我是分出PBMC后再分出单核和T细胞，共培养5天，培养时间太长会是细胞碎片多的原因么? 图1 门意外的细胞也是碎片么？ FVD我是从-80冰箱取出，恢复室温后加入到细胞悬液的，我加的量是100ul细胞悬液0.1ul.老师说的室温下平衡一下是回复室温么？
       感谢老师的回复~谢谢
               

niwanmao

zhang65103 发表于 2015-11-15 22:15
谢谢老师！我是分出PBMC后再分出单核和T细胞，共培养5天，培养时间太长会是细胞碎片多的原因么? 图1 门意 ...

1、培养时间长是碎片多的原因之一。
2、是指回复室温。从你的图上看没染上，可以考虑回顾一下染色步骤，对照一下说明书哪里出了问题，检测完了用FVD/SSC散点图查看一下。

zhang65103

niwanmao 发表于 2015-11-16 15:36
1、培养时间长是碎片多的原因之一。
2、是指回复室温。从你的图上看没染上，可以考虑回顾一下染色步骤， ...

  谢谢倪老师~
  我染FVD是100ul的1%BSA加0.1ulFVD,1%BSA是用PBS配的。染完色之后因为条件限制没有即刻上机，是用1%多聚甲醛过夜再上机检测的，这样过夜会不会对染色有影响呢？
老师还有一个问题：我用Anti-CD3活化T细胞，那之后染色不能用CD3染了吧？ 但是如果用CD4染的话，我在上机之前加了PMA刺激，CD4会内吞，如果染胞内CD4，那不还有没内吞的CD4在细胞膜表面么？好像有点钻牛角尖了
    感谢老师的回复！

niwanmao

zhang65103 发表于 2015-11-16 18:16
谢谢倪老师~
  我染FVD是100ul的1%BSA加0.1ulFVD,1%BSA是用PBS配的。染完色之后因为条件限制没有即刻上 ...

FVD我没用过，我用过live/dead，只做个未固定的。如果protocol允许这么做，就照做。

用CD3活化后，如果担心有问题，可以考虑CD5嘛。

zhang65103

在文献好像没怎么看到染CD5，所以没做过，谢谢老师，下次试一下。