斑马鱼眼睛细胞转染GFP的流式分析

依果依果

斑马鱼眼睛细胞转染GFP实验，流式FSC/ SSC图不知道怎么圈细胞，细胞4-5um，和碎片很难分开，见附件图，求教怎么圈门。

niwanmao

对于小颗粒的检测还是存在一定技巧的，我个人的建议如下：
1、建议在检测前跑一下较长时间的蒸馏水，然后再上一管蒸馏水，设置合适的阈值，查看FSC/SSC散点图（两个参数均调节为LOG模式）的信号多少，确定管路干净了再跑。

2、将FSC和SSC均调节为LOG模式，以利于小颗粒信号能到散点图中央区域附近。


3、可以考虑用空载质粒的斑马鱼眼睛细胞做阴性对照，然后再检测GFP转染的细胞，如果有阳性，马上就可以圈出来，再反过来看这类GFP阳性细胞在FSC/SSC上的位置，这样应该就可以将细胞与干扰信号区分开。

4、（3的替代方案）可以找2um和4um的微球（Spherotech或Rainbow），先跑一下，确定位置，圈上门，同时也了解了背景干扰信号的多少，心里有数，然后再上斑马鱼眼睛细胞，就可以在FSC/SSC上较明确地圈出斑马鱼眼睛细胞，然后再看这类细胞的GFP表达情况（此处最好也有空载质粒做阴性参照）。

didi_zhou

按照倪老大的说法就没问题了。FC500分辨4、5μm的颗粒基本是没有压力的。主要是FS/SS要用Log（所有的，只要用到FS、SS就用Log），电压也不用太大，先跑溶剂（就是重悬液），看看噪音，这个时候要注意阈值，因为用的是Log可能阈值要设在1~10之间，FC500上写的是Des.(descrimination)，默认是100，如果不改的话，就会像最后的Log图上，FS只剩最后一个Decade了。
建议是跑水的时候留一点点噪音的尾巴，号区分噪音与细胞。
最后FC500对小颗粒检测其实是有机关的（其实Beckman的机器基本上都有各种小颗粒检测机关），你打开盖子就可以看见，一般大角度FS适合检测小颗粒，小角度适合区分大颗粒（或死活），不知道你那台默认放在了哪里，如果分不出的时候可以调整一下。不过应该没有什么问题，0.5的与噪音都可以分开，除非悬浮液比较多大的杂质颗粒。
还有，画GFP阳性的时候最好用FITC/SS。
祝你实验成功。

依果依果

niwanmao 发表于 2016-1-6 15:51
对于小颗粒的检测还是存在一定技巧的，我个人的建议如下：
1、建议在检测前跑一下较长时间的蒸馏水，然后再 ...

谢谢，之前试过用PI法染色将死细胞区分出来但也没什么效果。下次实验试一下倪老师您的方法。

依果依果

didi_zhou 发表于 2016-1-6 22:16
按照倪老大的说法就没问题了。FC500分辨4、5μm的颗粒基本是没有压力的。主要是FS/SS要用Log（所有的，只要 ...

可能细胞碎片多，因为做了分选，但分选出来的细胞状态不好，没法养，不知道是不是碎片。