本帖最后由 winnebenben 于 2016-6-8 00:06 编辑
最近要检测一批鸡血,是做T淋巴细胞亚群的,之前也做过,但这次标本量比较多,而且带我的老师离职了,所以之前堆积的问题想求解一下,麻烦各位帮忙. 首先把实验材料及操作步骤先贴上来:
1、实验材料 (1)实验设备及耗材：流式管、漩涡混匀振荡器、低速离心机、移液器、Tips、200目滤膜、流式细胞仪(BD FACSCalibur) (2)所需试剂 1)荧光标记抗体Mouse Anti-Chicken CD3-SPRD、Mouse Anti-Chicken CD4-FITC、Mouse Anti-Chicken CD8a-PE （Southern Biotech） 2)红细胞裂解液（BD公司） 3)PBS溶液（TaKaRa公司） 2、实验操作步骤 1）加抗体：取流式管，做好标记，分别吸取5ul的CD3、 CD8a抗体和3ul的CD4抗体加入到流式管底； 2）加血：混匀肝素钠抗凝的鸡全血，吸取50ul血样品加入到流式管中，振荡混匀，避光孵育15min； 3) 溶血：加入红细胞裂解液2ml，振荡混匀，避光孵育15 min； 4) 洗涤：加入2ml PBS溶液，1100rpm×5 min离心； 5）洗涤：弃去上清，重悬细胞，加入2ml PBS溶液，1100rpm×5 min离心； 6) 过滤：弃去上清，重悬细胞，加入500ul PBS溶液，过滤准备上机； 7) 上机检测：使用cellquest软件获取并分析数据。
操作过程中的问题： 1、鸡全血细胞溶血离心洗涤后有很多白色的肉眼看像细胞一样的东西，厚厚一层，重悬后均匀，无絮状沉淀及粗颗粒，可通过200目滤网，上机不会堵机器，但实际上CD3的比例很少，大部分都是一些不知什么东西，因为没有标记其他的抗体，也无从认证，有没可能是鸡红细胞是有细胞核的，白色的是溶血后红细胞的细胞核？ 下面是鸡血T亚群的FSC：SSC以及CD3+的图片，FSC：SSC一大堆细胞，但真正有CD3+的细胞就R1的那一点，左边还有一部分被我设置阈值切掉了。
2、由于细胞or颗粒太多，做的过程中时不时机器会死机，就是界面上一个细胞都没有，有点像堵了，但其实并不是，正常关机过一会儿再开机就又能正常使用了，这是什么原因？
3、由于标本太多（大概几百管），我能不能预先把三种抗体按比例混合，以减少逐个加抗体耗费的时间？会不会对图和结果有影响？
4、对方第一天采血，血样第二天才到我们手里，如果当天的血做不完，是否需要放4°C冰箱？怎样存放才能最大限度合理保存标本？
5、标记好的样本需要在多少时间内上机？我们没有固定液，以前试过今天标记好的样品做不完放4°C冰箱第二天检测，似乎对结果影响不大。
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发表于 2016-6-7 23:58:48
发表于 2016-6-7 23:58:49
，因为几乎都搜不到用鸡全血做流式的帖子，做了那么多次发现鸡血细胞溶血后真的很多不明颗粒，无法分离，而且流式图都是这样子，等下次做的时候po几张溶血后的图上来您就明白了。 之前工程师来看过说不是液路堵了，就是一下子当机了，可能一是标本颗粒太多，机器处理数据处理不过来，二就是我们的流式细胞仪年代久远，之前做小鼠样本也出现过这种情况，也是正常关机后过一会儿重启就又正常了。
