空白显示电压过低，单染却显示电压偏高。神奇还是见鬼.....

farmer000

空白显示电压过低，单染却显示电压偏高。
都说我的电压低，建议调高。为什么单染不低呢？  


不懂不敢调。

farmer000

如果以空白对照做参考设阈值，笑话就大了

niwanmao

farmer000 发表于 2016-6-25 20:32
如果以空白对照做参考设阈值，笑话就大了

不知道你染了什么抗体，什么荧光。
空白对照绝对不能做阈值参考，无论是单染还是多色，都存在荧光渗漏以及抗体的非特异性结合等各种背景增高的因素。

Arcrain

       楼主大概是用PE-CY7抗体标记破核膜的T细胞（PE-Cy7通道上一般就都是用这个染料了，PE-eFluor780好像很少有人用），楼主所说的那个单染应该是实验组阴性对照，看到这个样本信号比unstained tube高太多了，无所适从。
      细胞破膜后用抗体染色，抗体更容易与细胞内非常复杂的各类蛋白质非特异结合，目标蛋白的同源或结构近似蛋白，抗体滞留等等都会造成背景显著升高，这是显而易见的，相信楼主也明白。楼主的图显示电压的确偏低，且有可能单染样本的抗体是按照厂商推荐量直接加进去的。另外，请问楼主用的是什么机器？cytoflex？X坐标轴右侧仅仅只到10e3，这个动态范围应该是显示问题，不会是机器本就是这个样子，右侧肯定还有更高阶的对数范围没有显示出来，因此完全可以调高电压。
   胞内染色尽量避免使用PE-Cy7这类分子量巨大的荧光染料偶联抗体，既容易非特异性滞留，又难以到达抗原结合部位。而应该首选小分子量荧光染料偶联抗体，如FITC。（具体如何看实验设计和检测效果）
     以上只是根据有限信息进行的一些推断，仅供楼主参考。
      
     本不想回应解释，想想还是建议楼主心态平和的深入了解一下流式技术。另外，纠正一下，楼主的几篇贴子里总是提到“阈值”这个词，事实上楼主指的是阴性和阳性细胞的分群界限，在这些例子当中不应该使用“阈值”这个专用名词。