鱼类sIgM+细胞检测

yangswmy

          各位大神，我在提取鱼类白细胞，利用抗IgM抗体做流式，在荧光显微镜下发现荧光在细胞上呈点状分布，有些不正常。提出白细胞后，立即沉降固定，细胞变大，做间接免疫荧光无阳性信号；白细胞在4度放置1d后，沉降固定，部分细胞变大，做间接免疫荧光未变大细胞部分呈阳性，阳性信号不呈点状分布，与以前结果相似，请问这种情况可能是哪方面的原因，应该怎么解决？

niwanmao

你问的是免疫荧光结果直接标记和间接标记结果不一致的原因？

yangswmy

niwanmao 发表于 2016-8-1 18:21
你问的是免疫荧光结果直接标记和间接标记结果不一致的原因？

不是，我流式和免疫荧光都是间接。
我怀疑在提取白细胞时有步操作暂时使细胞抗原可逆性失活，影响了接下来的实验。
我提取白细胞的操作是本试验的成熟步骤，开始以为是我抗凝剂由肝素钠替换为EDTA的原因，后来换回肝素钠，结果稍微好一点，但主要问题没有解决。

niwanmao

yangswmy 发表于 2016-8-2 16:49
不是，我流式和免疫荧光都是间接。
我怀疑在提取白细胞时有步操作暂时使细胞抗原可逆性失活，影响了接下 ...

你是用什么提取白细胞？

yangswmy

niwanmao 发表于 2016-8-2 18:11
你是用什么提取白细胞？

Percoll密度梯度离心

niwanmao

yangswmy 发表于 2016-8-2 18:55
Percoll密度梯度离心

我有个疑问，鱼类白细胞是不是也应该绝大部分是粒细胞，少量B细胞？如果是的话，应该sIgM少量阳性才是对的，那么你在过夜之后出现的阳性是否可能是非特异性染色？另外，如果你是分析B细胞上的IgM，为什么不用CD19之类的B细胞标记设门呢？

yangswmy

niwanmao 发表于 2016-8-2 19:49
我有个疑问，鱼类白细胞是不是也应该绝大部分是粒细胞，少量B细胞？如果是的话，应该sIgM少量阳性才是对的 ...

文献表明，鱼类白细胞中sIgM阳性细胞在20%-50%之间。而且，目前我做的这种鱼还没有CD19的抗体

niwanmao

yangswmy 发表于 2016-8-3 14:43
文献表明，鱼类白细胞中sIgM阳性细胞在20%-50%之间。而且，目前我做的这种鱼还没有CD19的抗体
...

嗯，有文献的话，应该也会有流式图可以参考，你是否对比过文献的图和你自己的图？可否将两张图都传上来看看。