细胞荧光值的采集

whylb

请教一个问题：我有两个稳转细胞系，一个带GFP荧光蛋白，一个带TurboRFP荧光蛋白，把它们按1:1混合，药物处理后会有细胞融合现象发生，发生融合的细胞荧光显微镜下呈现黄色，能通过流式把这些不同的荧光值采出来吗？看下不同颜色的荧光细胞各占比例多少？

chymanhz

黄色的细胞知道具体波长吗？理论上的黄光在580-600之间，但是如果是黄绿色就比较麻烦，刚好在560-580之间，GFP在525nm左右，turboRFP正在574nm左右，所以感觉上应该会有问题。人眼分辨波长变化的能力还是比较高的

whylb

黄色的细胞是那两种细胞融合后的荧光，所以不知道它的具体波长。

niwanmao

whylb 发表于 2016-8-16 20:52
黄色的细胞是那两种细胞融合后的荧光，所以不知道它的具体波长。

你们流式仪器能测几色？要么把相关可能出现的通道看一下，看变化趋势。

小憨

这不就是相当于双标的流式检测吗，GFP在一般在FITC通道检测，RFP的话你再查查发射波长，对应一下你的流式细胞仪看看在哪个荧光通道检测比较好；最后利用不发荧光的细胞各自与上述两种发荧光的细胞进行混合，就可以用于调节补偿了。融合的细胞应该是双阳性的。

whylb

niwanmao 发表于 2016-8-16 21:33
你们流式仪器能测几色？要么把相关可能出现的通道看一下，看变化趋势。 ...

红色 绿色都可以测，关键这两个荧光蛋白的激发光不一样，还有就是双阳性的融合细胞怎么测它的荧光值，本人刚接触这块，所以很多不太懂。

niwanmao

whylb 发表于 2016-8-17 09:15
红色 绿色都可以测，关键这两个荧光蛋白的激发光不一样，还有就是双阳性的融合细胞怎么测它的荧光值，本 ...

@小憨  说的也对，这两个蛋白在细胞融合后，应该还是单独存在于细胞内的，可以算作双染，那么你就在流式上检测FL1和FL2两个通道的荧光变化即可。

whylb

niwanmao 发表于 2016-8-17 11:04
@小憨  说的也对，这两个蛋白在细胞融合后，应该还是单独存在于细胞内的，可以算作双染，那么你就在流式 ...

老师，还有个问题，这两种荧光蛋白的激发波长不一样，一个488nm激发，一个是560nm激发；发射波长488nm下的是525nm，560nm下的是590nm。这样的话，融合后的细胞也就是双阳性的细胞能检测到荧光值吗？

niwanmao

whylb 发表于 2016-8-17 16:21
老师，还有个问题，这两种荧光蛋白的激发波长不一样，一个488nm激发，一个是560nm激发；发射波长488nm下 ...

是的，理论是两个细胞融合后，出现双阳性。