刺激实验，检测凋亡

xiandaxie

大家好，请教关于检测凋亡的问题。

@niwanmao
倪老师，您好。向您请教个问题：
我做阴选B细胞刺激实验，利用7AAD和Annexin-V-APC来检测培养2d后，刺激组与不刺激组细胞凋亡的情况（BD公司），检测机器C6。

上机分组如下：
A07:unstain
A08:7AAD单染
A09:AV-PE单染
A01:未刺激组
A02:刺激组

1.分组是否合适？
  a)有提议说增加阳性对照（早凋组：细胞55℃ 5min+晚凋组：细胞55℃ 15min）
   b)如果我需要分析分别刺激2d、3d、4d的凋亡情况，是否每一天都需要做unstain、单染组、阳性对照组


2.如何选中正确的细胞进行分析？刺激2d后，从FSC和SSC参数来看，细胞分成三群，分析的时候该选哪一群，并且排除掉细胞碎片


3.以lymphocyte画门为例，压线较多，此种情况分析是否可信？

niwanmao

1、单染组调节补偿做一次就够了。阳性对照主要是排除染料试剂出问题的情况，如果你的染料没有问题，那就没必要再重复了。所以如果补偿调节好了，染料确定没有问题，那么每次只需要直接做实验管即可。

2、由于C6的数据在Flowjo等软件上显示会有点问题，所以建议尽量在C6的软件上直接分析。至于选哪群细胞，需要每一群都看过。

3、这些在坐标轴外的信号有可能是由于数据不兼容引起的，所以建议C6上直接分析。如果真的是跑外面去了，问题也不大。

小憨

7AAD在C6上好像是3通道检测，APC标记的Annexin V应该是4通道吧……
你要是把7AAD换成PI的话应该就可以用2通道（PI）和4通道（Annexin V APC）检测了，不用调节补偿

niwanmao

小憨 发表于 2016-9-6 14:05
7AAD在C6上好像是3通道检测，APC标记的Annexin V应该是4通道吧……
你要是把7AAD换成PI的话应该就可以用2通 ...

眼睛亮的，我刚才没注意到他的坐标。不过C6的数据在Flowjo上显示不太好。

xiandaxie

niwanmao 发表于 2016-9-6 12:12
1、单染组调节补偿做一次就够了。阳性对照主要是排除染料试剂出问题的情况，如果你的染料没有问题，那就没 ...

谢谢倪老师的耐心解答，另外针对第二个问题，目前这三群分析出来的结果不尽相同，出现这种情况该选择哪一群比较反映真实的凋亡情况呢，还是选择除了碎片以外的所有细胞？谢谢！

niwanmao

xiandaxie 发表于 2016-9-8 21:57
谢谢倪老师的耐心解答，另外针对第二个问题，目前这三群分析出来的结果不尽相同，出现这种情况该选择哪一 ...

应选择除碎片外的所有细胞。