流式估测DNA含量的技术问题

guan

我在用FlowSight估测真菌孢子的DNA含量时，用70%乙醇过夜固定后，用PI染色30min 后发现孢子的整个细胞质部分也染上色发出黄荧光，PI不是细胞核染液吗？为何会出现这种情况呢，是否PI染色后进行脱色处理更好？另外我的阴性对照组也发现核染色发出荧光，是否是生物的自发荧光现象呢？还是和我的阴性对照组固定了有关？



阴性对照组

阴性对照组

               


细胞质荧光过重

实验组细胞质部分荧光强

niwanmao

首先，好羡慕你用上这台机器，一直很想玩玩，可好贵。

PI是核酸染料，如果你的标本未经过RNA酶处理，就可能把RNA也染上，而RNA可不止存在于核内，还存在于胞内。所以下次你在配制的PI染液内加入RNA酶，可避免这种情况出现。染液配方站内Protocol版块可找到。

guan

倪老师，我在加PI之前用RNAse A 37℃水浴了1h，应该将RNA除尽了，阴性对照组是否不需固定。

niwanmao

guan 发表于 2016-9-9 08:03
倪老师，我在加PI之前用RNAse A 37℃水浴了1h，应该将RNA除尽了，阴性对照组是否不需固定。 ...

阴性组也需要同样处理的，阴性组准确地说应该是生物学阴性对照。
RNAse A的效果还需要注意一下。

guan

是不是将RNAse A和PI配在一起效果比较好，另外样品固定时加入-20℃预冷的乙醇后原因是什么呢置于4℃固定24小时，为什么乙醇要低温固定呢？另外用PI染色时常温还是4℃效果好呢？原因是什么呢？

chymanhz

我也很羡慕啊，只大概看了看仪器

niwanmao

guan 发表于 2016-9-9 16:58
是不是将RNAse A和PI配在一起效果比较好，另外样品固定时加入-20℃预冷的乙醇后原因是什么呢置于4℃固定24 ...

配在一起可以，配方如下：
在10 ml 含 0.1% (v/v) Triton X-100的PBS中加入2 mg DNase-free RNaseA和200 µl  1 mg/ml PI。
分开加也可以。

乙醇关键是冷，是否严格-20度问题不是很大，主要是为了使细胞保存单细胞状态，减少粘连。
PI染色常温或37度均可。

详见：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-1330-1-1.html

guan

倪老师，PI染色后是否进行脱色处理后，减弱本底荧光，使样品成像的图片更加的好呢？另外脱色的话有什么好的方法推荐呢？

niwanmao

guan 发表于 2016-9-13 06:50
倪老师，PI染色后是否进行脱色处理后，减弱本底荧光，使样品成像的图片更加的好呢？另外脱色的话有什么好的 ...

脱色？这个我没听说过。我个人觉得还是从RNAse处理效果着手解决这个问题比较好。