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[流式相关软件] 流式细胞检测结果往左偏移

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发表于 2016-9-20 17:33:27 | 显示全部楼层 |阅读模式
悬赏4流星未解决
请教一下,如图我先做的表面染色 然后胞内染色    第一张图是我的空白对照 第二三是我的未刺激组合刺激组  然后 实验组比空白组往左偏移好多
1.有人说是第一张图非特异性太高  。 我分实验组之前是会将细胞预混一下然后进行分组 细胞状态 每一个应该都是一样的
2.有人说电压飘了  但是我一共做了十组,只有三组往左偏移明显 其他组正常
想请问一下 这种左偏如何可以避免?
  胞内染色步骤:破膜之后,洗涤细胞时是否要加大离心速度,破膜的细胞会自己恢复么,我是二步法染色胞内,所以我的一抗是和破膜一起做的,那我的二抗加入的时候,是否也要加入破膜剂?
希望大手们的解答。

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发表于 2016-9-20 18:29:26 | 显示全部楼层
空白对照用的是什么细胞?
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 楼主| 发表于 2016-9-20 18:59:40 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2016-9-20 18:29
空白对照用的是什么细胞?

空白组和实验组都是采用的PBMC细胞,空白对照组和实验组唯一的区别就是没加细胞因子抗体
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发表于 2016-9-20 19:34:37 | 显示全部楼层
小青菜 发表于 2016-9-20 18:59
空白组和实验组都是采用的PBMC细胞,空白对照组和实验组唯一的区别就是没加细胞因子抗体 ...

首先,需要明确一下,空白细胞不是用来作为设门参照的,而是用于确定电压大致范围,上过就算数,不用再去用,所以无论它在什么位置,不需要管它。
其次,设门建议用未刺激组作为阴性对照。

至于你问的为什么会发生这种变异,因为尽管都是PBMC,胞内细胞因子染色时,含固定破膜步骤,会造成细胞形状发生变化,同时也会造成荧光改变,所以会和什么都不处理的空白对照相差甚大。如果你把空白对照也进行固定破膜,你就会发生细胞群也会向左漂。
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 楼主| 发表于 2016-9-20 19:51:24 | 显示全部楼层
niwanmao 发表于 2016-9-20 19:34
首先,需要明确一下,空白细胞不是用来作为设门参照的,而是用于确定电压大致范围,上过就算数,不用再去 ...

我是这么想的①空白对照组只是不加细胞因子抗体,其他和实验组一样也会有固定破膜的操作
之所以设置这个组我是想观察 有些细胞因子不刺激体内也会有分泌 所以空白组应该和未刺激组也会有差距
②我做实验的目的是筛选 比较同一细胞因子的不同抗体那个比较优秀 所以背景值需要尽量低  我想通过比较空白和未刺激  未刺激和刺激 这样两两比较来筛选 比较好的细胞因子抗体的
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发表于 2016-9-20 21:50:14 | 显示全部楼层
小青菜 发表于 2016-9-20 19:51
我是这么想的①空白对照组只是不加细胞因子抗体,其他和实验组一样也会有固定破膜的操作
之所以设置这个 ...

1、用不加抗体的空白对照本身就是一个错误,你认为不刺激也会有分泌的话,应该是用未刺激组+FMO作为对照,可在站内搜索“对照”了解更多信息。
2、背景值也不能通过空白对照了解,原因同上。
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