出现了奇怪的实验结果

小青菜

如图所示 同样的一份样品，我检测出来的结果过却不一样①首先 阳性的细胞到底是部分右偏（如左图）是正确的 还是集体右偏（如右图）是正确的
②第二次实验检测结果 发现破碎的细胞特别多  我做的是胞内染色 二步法染色  我第一次一抗是和破膜剂一起加的 二抗是用1%BSA的PBS稀释 染的    之后有个师兄说破膜之后 细胞上的孔会自动修复 最好二抗也用破膜剂稀释  然后本次实验细胞碎片就很多  想请教一下 是不是我这次破膜剂的原因导致了碎片化严重  一共两个问题望不吝赐教

niwanmao

提问没有描述清楚，而且看问题看得都晕了。
1、你做了什么抗体？要分析哪群细胞？淋巴细胞？
2、哪个图是第一次，哪个图是第二次？
3、FSC/SSC散点图怎么样？没放上来。
一般流式的问题，尽量放原始文件上来，并把实验方案（包括使用的抗体荧光素、抗体名称等）、问题都描述清楚，提问就完整了。

小青菜

niwanmao 发表于 2016-9-24 22:50
提问没有描述清楚，而且看问题看得都晕了。
1、你做了什么抗体？要分析哪群细胞？淋巴细胞？
2、哪个图是第 ...

老师这是我的SSC和fsc的结果 我的实验方法是①先分离PBMC细胞 然后刺激阻断
②接着收集细胞，进行表面染色是CD4染色（647）  
③表面染色结束后进行固，然后加入针对IL-2的单抗（不带荧光），此时IL-2的单抗我是和破膜剂一起加的
④最后我再加入带荧光的二抗（488），二抗是需要稀释的 第一次做我用的1% bsa的PBS稀释的 第二次做使用的是工作浓度的破膜剂稀释的
老师我找了个同一种IL-2抗体两次试验的数据  在附件
①第一次实验 未刺激和刺激组
②第二次实验   未刺激和刺激组


主要想问的就是①第二次 ssc和fsc左下角很多点  是不是由于细胞破碎的原因 和我二抗使用破膜剂稀释是否有关联
                        ②两次实验结果 为什么第二次会出现两堆细胞 而第一次只有一群
麻烦老师了

小青菜

niwanmao 发表于 2016-9-24 22:50
提问没有描述清楚，而且看问题看得都晕了。
1、你做了什么抗体？要分析哪群细胞？淋巴细胞？
2、哪个图是第 ...

实验步骤  麻烦老师 看一下是否有错误的地方
1、BMC刺激
用细胞计数仪对PBMC进行细胞计数，然后在6孔板铺上细胞，每个样1mL，保证细胞数达到1x10^6cell/ml。保证每个刺激组对应一个未刺激组。在刺激组中加入10µl的1mg/ml的ConA,37℃培养4.5h后，在刺激组和为刺激组中加入1µL的BFA。
2、染色（离心全为4℃）
（1）细胞刺激完成后，收集细胞，离心，1500rpm，5min，弃尽上清，再加400ul的1%BSA的PBS洗涤细胞，弃尽上清。
（2）1：20稀释CD4抗，每个指形管加入100ul并且吹打混匀，避光染色20min。加1000µL的1%BSA的PBS溶液1500rpm，离心5min，弃上清，两次。
（2）每孔加入200ul固定剂，轻轻吹打混匀。室温静置20min。取破膜剂：1:9进行稀释，加400µL的破膜剂2500rpm，离心5min，弃上清，2次。
（3）每管加入100μL进行破膜，每种目的抗体各加1μL，轻轻吹打混匀，室温静置30min。加1000µL的破膜剂，2500rpm，离心5min弃上清，两次。
（4）加入用含1%BSA的PBS溶液稀释至工作浓度（1：2000稀释）的FITC标记羊抗鼠IgG，每管加入100µL，室温避光30min。加1000µL的pbs，2500rpm，离心5min弃上清，两次。最后用300µL1%BSA的PBS溶液重悬细胞，用FACS检测。

niwanmao

小青菜 发表于 2016-9-25 14:20
老师这是我的SSC和fsc的结果 我的实验方法是①先分离PBMC细胞 然后刺激阻断
②接着收集细胞，进行表面染 ...

胞内染色即可能用直接标记比较好一些，胞内染色本来就难做，你再做间接标记，很容易做不好。
我看了你的两次数据（如下图），两次都有一半以上的细胞碎片，不是说只有第二次才有，所以处理上肯定存在问题，至于什么问题，我觉得需要从各个环节找原因，例如离心速度、振荡力度、破膜剂的好坏 等等。

niwanmao

小青菜 发表于 2016-9-25 14:59
实验步骤  麻烦老师 看一下是否有错误的地方
1、BMC刺激
用细胞计数仪对PBMC进行细胞计数，然后在6孔板铺 ...

你后面几次离心2500转的速度太高，难怪这么多死细胞。1500最多。

小青菜

niwanmao 发表于 2016-9-25 15:13
你后面几次离心2500转的速度太高，难怪这么多死细胞。1500最多。

嗯嗯 谢谢老师 就还想请教一下 破膜剂会是细胞碎片过多的原因么？破膜后的细胞会再次恢复成不破膜的状态么？ 因为师兄说破膜后细胞会变轻 所以要加大离心转速的

niwanmao

小青菜 发表于 2016-9-25 15:43
嗯嗯 谢谢老师 就还想请教一下 破膜剂会是细胞碎片过多的原因么？破膜后的细胞会再次恢复成不破膜的状态 ...

不会，你们想多了。

hbezyr

小青菜 发表于 2016-9-25 15:43
嗯嗯 谢谢老师 就还想请教一下 破膜剂会是细胞碎片过多的原因么？破膜后的细胞会再次恢复成不破膜的状态 ...

你们师兄真厉害。

质量不守恒，死细胞的细胞膜有流动性，细胞经过固定后还是活的

以上三个，任何一个做出确切证据来，都可以改变世界了。

浪漫纷飞

加个染死活细胞的吧。死细胞太多，怎么分析？都是阳性的。