〖给新手的PPT〗流式细胞术介绍

niwanmao

经常发进展和进阶资料，也得照顾一些新手，这不，今天发一篇30多页的PPT，来自新南威尔士的Rob Salomon的Introduction To Flow Cytometry，内容挺全，从流式的概念到荧光、补偿、分选，都介绍到了，尽管不细，但作为给新手们的一个入门读物还是不错的。

下面开始吧，标题页跳过，直接来正文。首先，看流式细胞术单词flow cytometry的含义，包含了流动的、细胞、测量等意思。


流式细胞术检测需要三个东西：
1、单细胞悬液（如果是组织标本需事先通过物理或酶法解离）
2、荧光探针标记的抗体（或通过间接标记）
3、流式细胞仪



流式细胞仪工作原理：通过检测光信号，收集细胞的物理学参数和相关表型参数


流式细胞仪内部包含液路、光路、电路等（当然，软件其实也非常重要）。


通过流式，我们看到了哪些信号？一个是在一定大小范围内可反映细胞大小的前向散射光（FSC）、一定程度上可反映细胞内颗粒度的SSC，还有一类就是荧光信号，包括了FITC、PE、APC、GFP等等。


通过常见的FSC/SSC散点图理解一下这两个物理参数的含义。



利用荧光素染料或者荧光标记的抗体，可检测各类蛋白（包括细胞表面和胞内的抗原）、RNA、DNA、DNA合成情况、染料外排（主要是干细胞）、细胞器活性、pH值变化、蛋白相互作用、细胞分裂等等。


荧光染料之所以能够发出荧光，是因为荧光分子被一定波长的激光激发后，能量提升至激发态，然后激发态荧光分子会释放出这部分能量，表现为光子，被检测器检测到。



如何选择荧光素标记的抗体呢？首先得看这种荧光素标记的抗体有没有，其次荧光素亮度，接着看激发光源波长和发射光检测器的波长范围，最后看同一管里面的其它抗体或荧光素是否适合搭配。


选择荧光素还需要注意与其它抗体之间的补偿情况，因为荧光素发出的光都是有一个范围的，所以不可避免与附近通道的荧光存在光谱重叠现象，例如FITC和PE，为此，需要从通道中减去漏进来的光，使其反映真实的荧光强度，这就是调节补偿。


我可以用多少种荧光素呢？大多数流式用的是1～3色，一般表型检测用6～8色，复杂的方案用11～12色，更高的用17色甚至更多。


然而，随着单管中荧光素数量的增多，数据就会越来越复杂，越来越难分析。


流式结果的展示有多种图形，例如下面展示的是散点图、密度图、等高线图、直方图。


流式细胞术最常见的用途包括：

表型分析（包括科研的淋巴细胞亚群和临床免疫分型等）
凋亡和细胞死亡
细胞周期、细胞分裂和DNA合成
转导、转染情况
细胞跟踪（主要是CFSE和PKH等细胞增殖）
小颗粒分析（例如现在的外泌体）
功能分析（如钙流、基因表达、染料外排、线粒体膜电位等）
水生生物和微生物鉴定

为什么要使用流式细胞术？

1、快速获取（1秒钟可以获取3000～20万个事件，20万个我个人倒是没见过，不知道是不是那些声波聚焦的仪器？）
2、可实现单细胞分析。
3、结果可定量。
4、多参数分析。
5、统计学相关性好。

普通流式和图像流式之间的对比，所谓图像流式就是在获取常规流式那些荧光信号的同时，还对细胞进行拍照，尽管照片比较模糊，但是可以将细胞形态和荧光结合起来看，这类仪器目前偏贵。



流式再深入一些，就是分选了，分选就是你看到什么就可以把它分选出来，这方面的内容PPT里面就没有深入介绍了。



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clz281

流式细胞术可以检测“染料外排”的功能分析，染料外排（主要是干细胞）。那么染料外排从生物学角度是怎样理解的？

niwanmao

clz281 发表于 2016-11-1 08:52
流式细胞术可以检测“染料外排”的功能分析，染料外排（主要是干细胞）。那么染料外排从生物学角度是怎样理 ...

干细胞对Hoechst染料的外排，提示了干细胞自我保护的一种功能，可防止在用药时对干细胞的一种杀伤作用。

clz281

clz281 发表于 2016-11-1 08:52
流式细胞术可以检测“染料外排”的功能分析，染料外排（主要是干细胞）。那么染料外排从生物学角度是怎样理 ...

由于干细胞对器官的更新非常重要，所以它当然具备非常强大的细胞膜泵功能以避免有害物质的入侵。已知某些干细胞对罗丹明123和Hoechst 33342具有特殊的高效排出功能。Hoechst 33342可结合至DNA的A-T富集区域。该染料可被紫外光激发（最大激发波长395nm），发出蓝光（最大发射波长450nm）。然而，当细胞发生凋亡或染料浓度增高时，发射波长可向红光区域移动。这种特性也可用来鉴定突变的干细胞。
       后来，相关文献上也查到一点点信息。

clz281

niwanmao 发表于 2016-11-1 18:29
干细胞对Hoechst染料的外排，提示了干细胞自我保护的一种功能，可防止在用药时对干细胞的一种杀伤作用。 ...

谢谢站长的指点