流式分选时是否使用DNase的问题

steven

各位老师大家好。

之前做流式分选时上样之前只用细胞筛过滤一下就分选了，最近两次除了过滤之外还在上样管中加入了DNase I，由于使用的是DNase I，钙镁离子都是必须的，所以在上样管中加入了钙镁离子。但是钙离子据说会加重细胞间粘连，所以不知道是否应该应用DNase。
相比未用之前，图像上看细胞分组的确更加清晰了，但分选之后细胞状态好像并不太好。有人说是钙镁的量加多了，这两种离子会损伤细胞吗？
希望有经验的老师可以给予指点，谢谢。

niwanmao

钙镁离子确实会增加粘连，但DNase可去除死细胞造成的粘连。
钙镁离子应该不会影响细胞活力的，是不是其它原因？

steven

niwanmao 发表于 2016-12-20 21:36
钙镁离子确实会增加粘连，但DNase可去除死细胞造成的粘连。
钙镁离子应该不会影响细胞活力的，是不是其它原 ...

谢谢老师回复

这是使用DNase前后的对比图，加入DNase后的图更符合发表的论文中的示例。
分离细胞的过程中方法都是一样的，FACS时选取相同的hoechst blue高信号区域（P1）分选。但是未加DNase的时候，P1区域的细胞尺寸（FSC）更大，是否是粘连引起的呢？分选后显微镜下观察，使用DNase的这次，细胞特别小，15微米左右，未加Dnase的时候，细胞大小20微米左右，肉眼能观察到很明显的区别，这又是什么原因造成的呢？想不明白。难道同样是hoechst blue高信号区的两次分选不是一种细胞？
机器是aria III，375nm，2.0滤镜，purity模式分选。
希望得到回复，谢谢。

steven

大家都放假休息了么？谁来帮帮我啊

小憨

steven 发表于 2016-12-21 10:44
谢谢老师回复

这是使用DNase前后的对比图，加入DNase后的图更符合发表的论文中的示例。

细胞大小不一样是不是渗透压造成的啊？高渗溶液细胞脱水变小，低渗细胞膨胀。我觉得DNAse不太影响细胞活性吧，你再多做几次试试，如果每次都是这样，才能说明是DNAse的问题，而且样本得是一样的。

niwanmao

steven 发表于 2016-12-26 11:26
大家都放假休息了么？谁来帮帮我啊

因为对此类标本没有经验，所以只能从理论上推测。
从你这两个图的FSC/SSC看，DNase处理后，尽管你觉得和文献上有些像，但实际上更像处理后诱导了凋亡。

steven

小憨 发表于 2016-12-26 12:30
细胞大小不一样是不是渗透压造成的啊？高渗溶液细胞脱水变小，低渗细胞膨胀。我觉得DNAse不太影响细胞活 ...

谢谢您的回复 如果是渗透压的原因的话 我这次只是额外加了钙镁离子，而且量很小，应该渗透压改变不太大吧，下次打算不自己加钙镁了，直接用HBSS（+）配置DNase试试看，主要是这次分选出的细胞虽然小，但是大小却符合文献报道，所以我对之前分选的细胞有点疑问，不知道是不是有哪种细胞也有自发荧光被选进来了。这是之前分选的细胞图片，其中有一些特别亮的小点，原来都认为是杂质了，这次分选之后看来，他们的尺寸和这次分选的细胞大小差不多，难道这些才是该分选的细胞，之前分选的大部分都是别的细胞？这个细胞没有什么表面标记物，分起来可真麻烦，只能从他本身的尺寸和自发荧光入手了。

steven

niwanmao 发表于 2016-12-26 19:46
因为对此类标本没有经验，所以只能从理论上推测。
从你这两个图的FSC/SSC看，DNase处理后，尽管你觉得和 ...

谢谢老师回复 我对凋亡不太懂，请问是怎么看出来的，我也去查查资料学习一下。

niwanmao

steven 发表于 2016-12-27 11:59
谢谢老师回复 我对凋亡不太懂，请问是怎么看出来的，我也去查查资料学习一下。 ...

一般细胞凋亡时，在流式图上大多会出现FSC比之前降低，你要么取一点分选后的细胞用Annexin V标记试试？

steven

niwanmao 发表于 2016-12-27 18:15
一般细胞凋亡时，在流式图上大多会出现FSC比之前降低，你要么取一点分选后的细胞用Annexin V标记试试？ ...

谢谢老师指导 我再实验的时候试一下