关于CD3间接抗体的检测

yezuixiaoxiang · 发表于 2017-1-11 14:53:34

现在手头有3个CD3抗体，想测试一下是否可以用于流式检测，用的细胞是Jurkat，二抗是Flour 488荧光二抗，有几个问题想确定一下：
1.细胞量：每管是10的6次方个细胞/100ul细胞悬液
2.一抗量：一般多少细胞对应多少抗体量呢，比如0.5ug-5ug？
3.洗液：a. 看到有些资料中写的是PBS，有些是1%FBS的PBS，还有别的几种，请问下有什么区别呢？
            b. 整个实验都用PBS可以吗，包括一抗二抗的稀释液？
4.固定液：固定液是1%多聚甲醛。
            a. 这个实验需要对细胞进行固定吗？如果需要，是在哪一步进行固定呢？
            b.另外，如果是二抗之后再固定，是否可以用1%多聚甲醛将细胞重悬后直接上机测，还是固定一定时间后用PBS洗一下，再用PBS重悬后上机测？
5.洗涤：一抗孵育完成后，细胞要振荡后再加PBS，离心洗涤还是不加PBS直接离心？

niwanmao · 发表于 2017-1-11 15:20:09

为什么不直接用人的外周血？外周血的T细胞CD3非常强。
Jurkat的CD3不一定强，尤其是那些传代很久的，可能性质都变了。

yezuixiaoxiang · 发表于 2017-1-11 22:34:26

niwanmao 发表于 2017-1-11 15:20
为什么不直接用人的外周血？外周血的T细胞CD3非常强。
Jurkat的CD3不一定强，尤其是那些传代很久的，可能性 ...

因为实验室里有Jurkat细胞，但是人外周血不好取，所以选用了Jurkat

Justin-威 · 发表于 2017-1-12 09:52:41

我也在做相同的实验，也是用的CD3抗体，样本也是Jurkat细胞。你的实验中有没有出现细胞不固定的话很容易聚团下沉，孵育过程中老是要振荡

Justin-威 · 发表于 2017-1-12 09:53:41

再请问下你那边1%多聚甲醛的配方，我老在用现成的4%的，不知道效果是不是太强了

Justin-威 · 发表于 2017-1-12 09:56:42

另外我做多次实验，发现间接法的非特异信号特别明显，二抗孵育前用山羊血清孵育下可以有效降低这些信号

yezuixiaoxiang · 发表于 2017-1-12 16:35:53

Justin-威发表于 2017-1-12 09:53
再请问下你那边1%多聚甲醛的配方，我老在用现成的4%的，不知道效果是不是太强了 ...

我以前做的是用CD3未纯化的腹水，用C6做的，结果还可以。这次用的是纯化的抗体，今天检测了一下，用的calibur仪器，竟然没有收集到细胞。不知道是不是cellquest软件设置的原因。
多聚甲醛是用8%的稀释的。

yezuixiaoxiang · 发表于 2017-1-12 16:36:51

Justin-威发表于 2017-1-12 09:56
另外我做多次实验，发现间接法的非特异信号特别明显，二抗孵育前用山羊血清孵育下可以有效降低这些信号 ...

请问你的二抗用的多少比例的，哪种二抗呢？你的具体实验步骤可否参考一下

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